miRNA  RT-qPCR相关疑惑，求战友们解答。

本人科研小白一枚，现在想测量两个细胞系中筛选的5个的miRNA表达量，但是最后miRNA的CT值都＞30，最小的一个miRNA的CT都有31.6，还有三个都是35甚至测不出来，但是两个细胞系的内参U6的CT值都好小，只有11左右。

我提取miRNA是用的天根的miRcute miRNA提取分离试剂盒，一皿细胞大概最后能提20u的RNA。逆转录用的锐博的 Bulge-Loop miRBA qRT-PXR Starer Kit试剂盒，最后cDNA为10u，qPCR是20u的体系。引物也是锐博公司设计合成的，茎环法。

PCR用的罗氏的96孔板，每个miRNA都做了三个复孔。 qPCR的20u体系中cDNA我没有稀释，因为每个miRNA都做了三个复孔花掉了6u，因此我现在每个miRNA只剩4ucDNA了。

我之前的师兄是做测过这几个miRNA的，有表达且有差异，但是我就不知道为嘛我测不出来，锐博的RT试剂盒好贵，一千多只能测20次，我这次测5个miRNA+U6就花了12次，而且qPCR没有稀释cDNA就直接用了，简直肉疼。

我有几个问题想向战友们请教：

1.我师兄之前用的是加尾法，但是我用的是茎环法，加尾法比茎环法更灵敏，这是不是就是我师兄能测出来我测不出来的原因？我是不是应该换一下加尾法的引物?

2.我做的三个复孔之间也有大概1个CT值的差异，是不是因为我加液的时候*头打到底了，最后有气泡影响的？但是我跑pcr之前是有2000转离心5min的呀。

3.如果茎环法测出来的结果最后就是这么多(靶基因CT值31/32，内参10/11)，是不是证明这个细胞系基本就不表达这个miRNA?

感谢各位战友了