关于重组肠激酶检测试剂盒的介绍与推广

重组牛肠激酶酶联免疫吸附测定试剂盒

试剂盒用途

该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组牛肠激酶含量。 本试剂盒仅供研究或工业生产用。

试剂盒基本参数

灵敏度 ≤ 1 ng/ml

检测范围：0.25 -16 ng/ml

特异性：可检测重组牛肠激酶，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。

工作时间：熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。

有效期：6个月

试剂盒检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测样品中的重组牛肠激酶含量。以抗重组牛肠激酶单克隆抗体包被酶标板，样品或标准品中的重组牛肠激酶与包被抗体结合，另一辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗重组牛肠激酶单克隆抗体与上述抗原-抗体复合物结合，以TMB为显色体系，在450 nm波长（参考波长650nm）处测OD450/650 nm值，重组牛肠激酶浓度与 OD450/650 nm 值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中重组牛肠激酶的浓度。

试验所需自备物品

1.酶标仪（滤光片波长450 nm和650nm）

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头

3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4.吸水纸

待测样品注意事项

1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。

2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。

3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

检测前准备工作

[size=10.5000pt]1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。

2．稀释液配制

  将浓缩标准品 & 样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1：25）。

3. 洗涤液配制

将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1：25）。  

  提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当日使用。

4. 标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为16ng/ml）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度: 16、8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml。

倍比稀释方法

取7只EP管，每管中加入500 μL标准品&样品稀释液，从16 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成8 ng/ml的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例（以500 μL为例）

提示：最后一管直接作为空白孔。

5. HRP标记抗体工作液配制

实验前请先将抗体管低速离心，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：250），当日使用。

6. TMB显色工作液配制

实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，用底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液 =1：20），当日使用。

洗涤方法

1. 自动洗板机：每孔加入洗涤液350 μL， 注入和吸出间隔60秒。

2. 手工洗板： 甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液350 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡2-3分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。

操作步骤

1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。

提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。

2.洗涤：弃去液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL，浸泡3分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

3.每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL，混匀，酶标板覆膜并置于37℃孵育30钟。  

4.洗涤：用洗涤液洗板4次，方法步骤同2。

5.每孔加底物显色工作液（TMB）100 μL，酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育

10分钟。

提示: 根据实际显**况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

6.每孔加终止液50 μL，终止反应，室温放置1分钟。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪*头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。

7.用酶标仪在450 nm波长（参考波长650nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。

提示: 请提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。

结果判断

1.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。

2.使用专业的曲线软件（如curve expert 1.3或ELISA Calc等）根据实验具体要求绘制标准曲线。

3.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。

4.典型数据

由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值可能有所差异。本试用试剂盒0.25-16 ng/mL范围的数据和曲线供参考，实验者可根据需求在此范围内选点建立标准曲线。

注意事项

1、 储存：试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染，否则可能会出现错误的结果。

2、 酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋，按温度存放。

3、 加样：加样和加同一试剂时，第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间，从而明显的影响到测量值的准确性及重复性，每次的加样时间最好控制在10分钟之内。设置复孔。

4、 温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。

5、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。

6、 试剂配制：试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用1000转/分离心一分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次，使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。

7、 显色时间的控制：加入底物后，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔五分钟），如梯度已经很明显，请提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数。

8、 底物：请避光保存底物。在储存和温育时，避免强光直接照射。

9、 混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器，使用最低频率，如无微量振荡器，可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

10、不同批号的试剂盒组分不能混用（洗涤液和终止液除外）。

11、关于样品回收率

1）本试剂盒以测定重组牛肠激酶的抗原性而非活力来推测蛋白残留量，因此试剂盒中标准品采用重组牛肠激酶的消光系数（E1%1cm=20.01D, 即当A280nm=2.01时，牛肠激酶浓度为1mg/ml）来计算其蛋白含量，并采用内部质控以最大限度保持标准品含量的精确和恒定。

2）不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中牛肠激酶的蛋白含量不完全一致，也会造成回收率的差异。为避免上述因素影响，建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法（A280nm）估算蛋白含量，再稀释至适合的浓度用于回收率测试，尽量减少回收率的误差。