关于用7-AAD 做CAR-T杀伤癌细胞（贴壁）的问题？

最近在做CAR-T杀伤癌细胞实验（贴壁），主要是CFSE/7-AAD试剂盒（如CAYMAN公司），主要步骤如下：

1.培养好癌细胞，然后消化癌细胞配成一定浓度的悬液。2.用荧光染料CFSE染色癌细胞，再放回12孔板（板未经过处理，10^5每孔 )。3. 加入培养好的效应细胞（CART/T），按一定的E/T比（如0:1, 5:1, 10:1, 20:1)。4. 效应细胞和癌细胞共培养12小时，然后用7-AAD染色，再上流式分析。5. 通过FITC圈门癌细胞，选择FITC/7-AAD（+/+）即为杀死的癌细胞。

但一直做的不好，想请做过的朋友指点下：

有几个问题：

1. 癌细胞可以用胰酶消化吗，不管是染CFSE前还是共培养结束后，消化会使得癌细胞表面maker去掉吗？
2. 共培养结束后，CART/T组通过显微镜肉眼观察差别还是比较大，T细胞组还有比较多的贴壁癌细胞，CART组基本就见不到贴壁癌细胞。但流式分析结果显示，CART/T杀伤癌细胞差不多，不知道是此方法的局限还是怎么回事？
3. 共培养时间以及E：T比选择有什么建议吗？
4. 共培养结束后，7-AAD是染色多久吗，目前是染色30分钟，我看有的说染色10-15分钟。
5. 此方法对杀伤贴壁细胞，要么CART/T细胞组都有杀伤（差值不大），要么就是都没有杀伤，而且baseline高（E:T=0:1).