病原宏基因组测序mNGS协助确诊新型冠状病毒
近日，武汉大学病毒学国家重点实验室、武汉大学中南医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院和中山大学医学院的研究人员通过病原宏基因组测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）在两例肺炎病例中检测出2019新型冠状病毒，研究结果发表在《Emerging Microbes & Infections》（IF = 6.212）杂志上。
患者信息
患者1：39岁男性，华南海鲜市场工作人员，因“发热（最高37.7℃）、咳嗽加重、痰中有白色泡沫5天”于2019年12月25日入院。
患者2：21岁女性，有华南海鲜市场工作人员接触史（2019年12月22日），临床症状为间歇性发热咳嗽、寒颤、发热（最高40℃）、痰中白色泡沫，于12月28日入院。
两位患者住院首日的临床实验室检测结果见表1，胸部CT均显示双侧胸膜下有散在的模糊影（图1），提示双肺可能存在病毒感染。但常规抗病毒和抗感染效果不佳，未缓解患者临床症状。患者1于2019年12月31日病情加重，精神状态不佳，呼吸急促，无氧吸入时血氧饱和度（SpO2）降至86%，复查CT示左肺少量胸腔积液，磨玻璃影密度增高，并且散在的区域有扩大。
表1. 患者住院首日临床实验室检测结果
图1. 患者胸部CT影像（a. 患者1；b. 患者2；2019年12月30日）
诊断过程：
2020年1月2日，两名患者均转入武汉传染病医院继续治疗。经治疗后，患者1和患者2分别于2020年1月12日和1月11日出院。
2020年1月3日，采集患者呼吸道及血液样本进行常规呼吸道病原体临床实验室检测，包括流感病毒、呼吸道合胞体病毒、腺病毒、偏肺病毒、支原体肺炎、衣原体肺炎、军团菌等，均为阴性。其余RNA样本根据WHO的建议进行SARS-CoV特异性RT-PCR检测，但只有一组实验结果为阳性。对相应PCR产物的进一步测序，发现该病毒与BtCoV/4991（97.35%）关系更密切，而与SARS-CoV关系不大（图2）。
图2. 第一轮RT-PCR检测、扩增及序列分析（A. SARS-CoV特异性RT-PCR检测结果，仅SAR1-s/as条带明显，1/6/11/16/21列为患者1样本，2/7/12/17/22列为患者2样本，其余列为其他患者样本；B. 患者1和2样本PCR产物的Blast结果）
2020年1月4日，对患者样本进行第2轮RT-PCR检测，在第1轮Blast分析的基础上设计新引物，对扩展的RdRp片段和更多的基因组片段进行鉴定、扩增、测序和分析（图3）。结果进一步表明患者病原体可能是冠状病毒，但不是SARS-CoV。从肺泡灌洗液（BALF）样本中提取的总RNA（2020年1月2日收集）进行宏基因组新一代测序（mNGS）文库构建。
图3. 第二轮RT-PCR检测、扩增及序列分析（A.用不同基因的多对引物扩增结果，1/3/5/7/9/11/13/15/17/19/21/23/25/27列为患者1样本，2/4/6/8/10/12/14/16/18/20/22/24/26/28列为患者2样本；B. 患者1和2样本PCR产物的Blast结果）
2020年1月5日，mNGS文库构建完成。
2020年1月6日，在Illumina Miseq平台上对文库进行150 bp双端测序。
2020年1月7日，获得测序结果，患者1和2的样本分别产生了7,369,020和4,522,558个reads。对测序结果分析发现，检测到的病毒reads中大部分与冠状病毒相关（样本1和样本2分别为99.9%和99.7%），另外在样本2中检测到嗜二氧化碳噬细胞菌和韦荣氏球菌，但这两种细菌的致病性尚未清楚。利用Megahit对reads进行从头组装，形成一个30 kb的与CoV具有序列同源的contigs。经过序列匹配确认，最终的CoV基因组为29,881 nt。
2020年1月8日，进行基因组比对和进化分析。mNGS结果显示，除少量SNP外，患者1和2共识基因组序列相同，表明两个患者在不同时间感染了同一冠状病毒。
进化分析
全基因组比较显示，2019-nCoV接近于在菊头蝠属（马蹄蝠）中循环的CoV。例如，与蝙蝠冠状病毒株BtCoV/4991 的核苷酸同源性为98.7%，与蝙蝠冠状病毒株bat-SLCoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的核苷酸同源性为87.9%，与目前已知的包括SARS-CoV（79.7%）在内的人类CoV存在较大差异（图4A）。
基于关键病毒基因（ORF1a/b、S和N）对2019-nCoV进行系统发育分析，发现基于ORF1b基因分析时，2019-nCoV最接近于分离自云南省某种菊头蝠（Rhinolophus affinis）的BtCoV/4991，而基于其他基因（ORF1a、S和N）分析时，2019-nCoV最接近于分离自中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus）的bat-SL-CoVZXC21和bat-SLCoVZC45。通过基因特异性系统发育分析，发现2019- nCoV与其他bat-SL-CoVs在不同基因上的系统发育不一致，提示可能存在重组事件（图4B）。但基于2019-nCoV、bat-SL-CoVZC45、Longquan-140和SARS-CoV基因组比对的Simplot分析表明，重组菌株不太可能是2019-nCoV，而是bat-SL-CoVZC45（图4C）。
图4. CoVs的起源和进化分析
研究人员表示，虽然与疾病的直接联系还有待更多实验数据的证实，但其研究结果提供了几条该病毒与疾病相关的证据：
1. 病毒滴度非常高，丰度达到总reads数的1.5%和0.62%，超过表达量最高的宿主基因，成为宿主转录组中最主要的RNA分子之一，这是病毒处于主动复制的重要标志；
2. RNA mNGS方法针对的是朊病毒除外的总感染组，而在患者样本中未发现其他病原体；
3. 该病毒为冠状病毒，存在人类交叉病毒传播史，具有强大的人畜共患病潜力。
从这项研究可以看出，mNGS在疫情爆发的早期协助研究人员确定感染原因。通过序列同源性分析，明确提示病毒与此前已知的可以感染人类的冠状病毒存在较大差异，且通过对病毒的基因序列进行进化溯源分析，成功锁定蝙蝠为病毒的自然宿主。此外，通过对两位患者体内的新型冠状病毒基因序列进行SNP变异分析，发现两者几乎完全一致，表明两个患者在不同时间感染了同一冠状病毒。因此，mNGS在此次疫情监测和防控中，发挥了至关重要的作用。研究人员表示通过mNGS评估潜在的病原体，是信息时代病毒诊断的未来趋势。
