USP787和USP788翻译

787 显微计数法在治疗性蛋白注射剂中的应用

1. 简介

本章可以替代USP常规章节“注射剂中的不溶颗粒”788。 它专门针对治疗性蛋白质注射剂和相关制剂，可使用较小的测试产品体积和较小的测试等分试样来确定颗粒物含量，并带有考虑了与这些材料分析相关的问题的样品处理说明。 尽管本章介绍的方法和限度是治疗用蛋白质注射剂的首选检测方法，但仍可接受其他经过充分研究的不可见颗粒限度的检查作为检测分析方法。

治疗性蛋白质注射剂是生物技术衍生的蛋白质或多肽产品，以及其他治疗性蛋白质注射剂，例如天然来源的治疗性蛋白质，包括其最终输注制剂。本指南不包括某些不适用于这些测试的制剂，例如预防性疫苗。

治疗用蛋白质注射剂中的不溶性颗粒可能有多重来源。颗粒可能是：

（a）真正的外在异物，例如不期望的外界物质，例如：纤维素。

（b）由于在制造过程中添加或清洁不足的引入异物，例如：罐内金属或垫片，润滑剂，填充硬件，或者由于时间过长，产品不稳定性产生的，例如：不溶性药物盐析出或包装降解。

（c）内在固有的异物，例如蛋白质或制剂成分的颗粒。

所有这些类型的颗粒都可以用本章介绍的测试方法进行检测和计数。另外，对于光阻法（LO），通常气泡也会被计数，并算作误差。为了确定治疗用蛋白质注射剂中的不可见颗粒，首选光阻蔽颗粒计数法。显微镜颗粒计数法类似于（788章）中的方法，一般用在所分析的颗粒为非蛋白质的情况下或在检查颗粒特性检查比较重要时。显微镜颗粒计数法的测试结果与光阻法测试的结果不可相互替换使用。当光阻法检测结果不符合或者产品不适用与光阻法的，用显微镜计数法，并以显微镜计数法的结果为准。

光阻法并不适用于所有的治疗用蛋白质注射剂的不可见颗粒检测。当光阻法不能直接适用于特定的测试样品时，可以使用适当的稀释剂对样品进行定量稀释，以便通过光阻蔽进行分析。但是这样处理，可能需要进行方法验证，以确保每种药物产品的样品处理程序和方法的适用性。例如，进行重复性，线性实验来验证样品的预处理方法。

通过检查单一样品或一组样品中的不可见颗粒结果无法确定地推论到其他未经检测的产品。因此，必须制定取样计划，以得出有效的检测结果，证明一批产品中不可见颗粒的水平。取样计划应基于（1）产品体积，（2）比较不可见颗粒检测结果历史记录和限值大小（3）颗微大小分布情况（4）不同生产工序中颗粒数量变化。对于在使用前应用终端过滤器的产品可免除这些要求，前提是可以使用科学数据证明合理性。

2. 光阻颗粒计数法

分析人员应使用一种基于光阻挡原理的合适仪器，该仪器可以自动确定粒径和数量。

选择的传感器必须符合预期的粒径检测范围和预期的检测颗粒数范围。以及标准化的考虑因素，例如样品进样体积准确度，样品流速，传感器分辨率，校准和颗粒计数准确度，对于正确使用仪器有重要意义。在通则一章（788）中确定了注射剂和眼用液体制剂中颗粒物的测定方法解决方案。

为了进行设备校准，使用NIST可追溯的粒度标准或等效的可追溯标准，请参阅章（1788）。这些标准通常在2至100μm之间。应使用以适当体积分散在无颗粒水中的USP颗粒计数标准品来校准设备。在校准过程中，必须注意避免分散过程中颗粒的团聚。试剂，指示剂和溶液的简介部分提供了无颗粒水的定义。

无颗粒水：通过0.22μm膜的纯化水。

2.1.一般注意事项

在限制颗粒物的条件下进行测试（最好在层流柜中）。

所用的玻璃器皿和设备应正确清洁和处理，以保持无颗粒。

应注意避免样品（对于液体或复溶粉末）的晃动和其他类似的操作。

当将样品于溶剂合并或转移到样品瓶中时防止气泡进入，这一点尤其重要。

2.2.准备步骤

选择使用的玻璃器皿应考虑空白样品和样品等分试样的体积，易于混合，并进行反复清洗以防止污染并对颗粒计数产生重大影响。一般建议，使用专属器皿用于此检测，且玻璃器皿的清洁和冲洗应紧邻检测计数区域，避免环境中颗粒污染。

检测工作区和检测设备应与一般实验区域分开。同时保持充足的0.22μm膜过滤水（以符合无颗粒水的要求）和辅助设备的使用，并可以用于正常的检测工作。请参见通用章节（1788）。

两种推荐的校准法：空白实验或系统适用性实验

1. 空白实验

在每天第一次检测前做空白实验，确保环境和设备已经处于合适的条件下。（环境空白）

通过在贯穿全天的空白实验（例如，不同批产品另做空白测试）都应符合空白实验 的要求。（程序空白）

2. 系统适用性实验

使用USP颗粒计数标准品或等效商业标准验证进行系统适用性实验，检查每毫升颗粒数和标准品比率是否符合。请参见通则（1788）

2.3.空白实验

目的：为了检查：（1）测试的环境是否符合；（2）玻璃器皿是否已清洁；（3）无颗粒水或其他使用的溶剂中有无颗粒。（2,3点共同构成“空白”）

步骤：取已脱气的无颗粒水或其他使用的合适溶剂的体积相同的5份进行不可见微粒检测，取无颗粒水的体积应参考产品样品的体积（但不少于1 mL）。对于5份样品的计数结果汇总，如果10 μm或更大尺寸的颗粒数量超过每毫升1个，则对测试采取的预防措施是不够的。重复清洁准备步骤，直到环境，玻璃器皿和水符合要求。每天的检测工作前必须先通过空白实验，并且建议在整个日常工作中穿插空白实验，尤其是在产品批间（程序空白）。

2.4.系统适用性实验

为了验证系统的适用性，用与产品或样品相同或相似容器配制无颗粒水和USP颗粒计数标准品或其他等效的商业标准水性悬浮液，以相同的方式脱气，并且进行与样品检测相同的预处理过程。应确保系统可以满足空白测试的要求。根据下述方法，确定使用的USP颗粒计数标准品量应考虑产品检测中颗粒物数量的范围。标准品检测的结果应在参考标准规定的范围内。

2.5.方法

取出待测样品时应该用最符合其使用方法的形式取出。（例如，推注出注射器内的待测样品）。对于体积足够的注射剂药物（即，体积足够用于检测），通常用一只作为样品进行检测。对于体积不够一次检测的注射剂药物，请仔细彻底地在一个单独的容器中汇集多支药品，以获取单次检测所需的体积（通常为0.2–5.0 mL）。如果进行稀释，请确保空白容器中有足够的空间容纳产品和稀释剂，并且在过程中避免引入颗粒。小心打开每个产品，取下密封盖，并避免在取样，稀释或溶液汇集之前污染样品。

当指定了产品溶剂时，例如，对于冻干固体或粉末，必须使用适当量的指定溶剂进行重构或稀释。在这种情况下，可以对溶剂本身进行测试以确保它不是重要的颗粒来源。但是不允许在产品用溶剂溶解后检测的不可见颗粒数量中减去溶剂中不可见颗粒数量作为最终检测结果。

消除气泡是关键的一步，特别是对于容易夹带气体的蛋白质产品而言。推荐两种消除气泡的方法：1.使产品液体在环境压力下静置；2.要么施加一个适宜的真空（例如75托）。或使用其他经过验证的方法。应尽量避免超声脱气处理。

样品脱气后，必须通过适当的方式（例如，用手缓慢摇动容器）将其内容物缓慢地，彻底地混合以悬浮所有颗粒。不建议在任何时候倒置混合样品溶液。

混合后立即取出不少于4份等体积溶液作为试样，每个试样的体积均应适合仪器的容量（通常为0.2-5.0 mL）。计算选定粒径范围内的颗粒数，包括等于或大于10和25μm的颗粒。忽略第一个试样的检测结果，并计算其余试样在每个粒径范围内的平均颗粒数。在设备取样中也可以设置皮体积，该体积应代表传感器的动态范围和针头的体积。

2.6.一般注意事项

只要稀释剂和方法经过验证其合理性（最小剂量的稀释后检测重复性得到验证），就可以进行稀释预处理。

在某些情况下，可能需要稀释样品以获得可靠的结果。例如：

对于高浓度产品或高粘度产品可能无法正确吸入仪器；

某个粒径范围颗粒计数过高而导致仪器传感器灵敏度饱和的产品，尤其是在小于1 0 μm的尺寸范围内；

以及高浓度导致溶液和蛋白质聚集体之间的折射率差异非常小的情况。

在进行样品稀释的情况下，稀释的基本原理以及所选稀释方案以及所选用的稀释剂必须得到验证。可以通过验证一定稀释范围内检测结果的一致性来评估稀释方案和稀释剂的适用性。应考虑检测粒径范围内进行稀释和不稀释样品检测的颗粒数量结果的线性研究。还应该进行探索研究稀释剂对样品的影响。例如：产生蛋白质聚集引起的颗粒数量减少，以及改变产品主辅料比例引起的颗粒数量增加。

2.7.评估

下面的接受标准是从通用章节（788和789）中得出的经验性数据。如果规格与下述规格不同，则将在可用的单独的专论中进行说明。

对于非胃肠道使用的，单支标量小于或等于100 mL的治疗用蛋白质注射剂或注射剂：单支产品中存在的平均颗粒数粒径≥10μm的颗粒不超过6000个，粒径≥25μm的颗粒应不超过600个。

对于非胃肠道使用的，单支标量大于100 mL的治疗用蛋白质注射剂或注射剂：单支产品中存在的平均颗粒数粒径≥10μm的颗粒不超过25个/ml，粒径≥25μm的颗粒应不超过3个/ml。

对于在使用前应用终端过滤器的产品可免除这些要求，但前提是可以使用科学数据证明免除是合理的。同时，滤液应符合指导原则。

对于产品初始含量不足100ml但需要添加溶剂稀释至100ml以上的进行使用的产品，应在稀释前后对颗粒含量进行评估，并根据其最终使用时体积的颗粒检测结果为标准。

3. 微观粒子计数法

如上所述，光阻法是用于治疗用蛋白质注射剂和其他注射剂不溶性颗粒检测的首选方法。不过也可以在适当的时候使用显微镜方法，例如：仅确定颗粒外部形状和颗粒特征。但是，应该保证在使用这种方法时，特征颗粒（例如，固有外形的颗粒）也被计算在颗粒总数之内。为了确定产品的可接受标准，请参考通则（788）章中膜显微法的限值。 由于某些蛋白质颗粒的干扰及其物理特性（易碎或半透明），显微镜计数法和光阻法的测试结果可能不同，并且这两种方法的检测结果不可互换。