G418筛选

G418筛选悬浮细胞

一、G418的性质以及配制方法

性质：G418 ：白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。

CAS No.：108321-42-2

分子式 ：C20H40N4O10 •2H2SO4 分子量 ：692.71

比旋：+104o～+121o 水分：≤10% 吸光值：≤0.015 (280nm，1mg/ml)， ≤0.1 (570nm， 100mg/ml)

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性 ，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。 G418有杀菌作用， 本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

配置：

方案一： 300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um

过滤，-20℃保存。

方案二：(1)配制1M HEPES：23.8g HEPES(缓冲能力更强)粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH(加量较多)调节pH至7.3，过滤除菌(较难过滤)，4℃保存，终浓度为1mol/L。

(2)5g G418溶于10ml 1M HEPES(pH7.3)，终浓度为500mg/ml，-20℃保存。

注：实验中采用方案二时效果较好。

二、G418筛选稳定表达细胞系实验步骤

1、制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml

24孔板，每孔1ml培养基(含有G418的完全培养基)，每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。

2、细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板(20000/孔)，12h换液，加筛选培养基培养。

3、确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度!心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞 ，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。

筛选之前

由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。

4、铺6孔板(20万/孔)，第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。注意：细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果(G418很难发挥作用)。

5、在换液一两次后(换液后培养过夜)，细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22um过滤，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用。

6、培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，即6中所配制。或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。

7、培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。

8、培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。

9、筛选约14天后可见有抗性克隆出现。

10、挑单克隆：高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。

11、单克隆鉴定：细胞大量扩增后，①提取总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达 ②western检测目的基因。

三、注意事项

培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1。死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2。孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。