你想要知道的关于慢病毒的知识

病毒系统的概述：

目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆转录病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。

慢病毒（LV）和γ- 逆转录病毒（RV）：均属于逆转录病毒科。其RNA基因组能逆转录为cDNA，稳定整合至宿主细胞基因组中。逆转录病毒通常分两种：γ- 逆转录病毒结构单一，慢病毒存在一些附属基因和调控基因。

腺病毒（ADV）：是一种复制缺陷型病毒，通过受体介导的内吞作用进入细胞，借助特定细胞系（HEK293）复制和增殖，不整合到宿主细胞基因组中。

腺相关病毒（AAV）：属微小病毒科，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以 AAV 被称作腺相关病毒。

下图是关于病毒的具体介绍:

慢病毒载体

慢病毒载体（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或 RNAi ）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA ，其基因组进入细胞质后，被自身携带的反转录酶反转录为DNA ，再进入到细胞核并整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录 mRNA ，回到细胞质中，表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰。

慢病毒的优势

慢病毒能够感染多种难以感染的细胞，如原代细胞、干细胞、非分裂细胞（神经元细胞）等。

慢病毒能将外源基因整合到细胞基因组中，稳定表达外源基因。

慢病毒感染筛选稳定细胞株所需时间较短。

免疫原性低，安全性高。

慢病毒包装流程：

名词解释：

结构基因*

Gag：编码p55蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白 (p17) 和衣壳蛋白(p24) 。

Pol：编码病毒复制所需的酶类。

Env：编码gp120和gp41两种包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。（被VSV-G替代）

辅助基因

Vif：编码产物与病毒体的感染性有关。

Vpr：编码产物的功能尚不清楚。

Nef：编码负调节蛋白,对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。

Vpu：编码产物与病毒的装配、成熟和释放有关。

调节基因*

Tat：编码gp14，一种反式激活的转录因子,与LTR (病毒基因组5’和3’端各有的一段长末端重复序列)结合后能促进病毒所有基因的转录。（去掉后会影响滴度）

Rev：编码gp19 ，能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。

专业术语：

慢病毒滴度（TU/ml）= 细胞数×103/病毒原液体积 (μl)

MOI=（病毒滴度×病毒体积）/细胞数目

Multiplicity of Infection（Mol）, 感染复数，指每个细胞感染的病毒颗粒数，MOI越高，细胞越难感染。通常把某株细胞有80%被感染时的MOI值作为该株细胞的MOI。

Polybrene：带正电的小分子，与细胞表面阴离子结合能促进慢病毒对细胞的感染效率，通常能提高2~10倍，但有一定细胞毒性，浓度需摸索，一般在1~10μg/ml范围。

常见问题回答

1、在病毒感染时，不同的细胞建议先做预实验，设置MOI梯度，选择最适MOI进行正式实验。

2、实际操作中，感染时是否加polybrene或稳株筛选时是否加嘌呤霉素可根据细胞状态而定，后续调整状态可适当提高血清浓度。

3、如何测滴度？

在载体感染靶细胞之前，需要滴定产生的载体以调整载体的剂量。载体效价对评估转导效率也很关键。可以使用不同的方法完成滴定：（1）测量载体制剂中载体颗粒组分的量（物理颗粒数量/ p24 衣壳浓度/ RT 活性/基因组拷贝数）; （2）测量感染细胞中的原病毒载体 DNA 拷贝数; （3）测量细胞中表达的转基因（通过流式细胞术或免疫染色）。