Trizol法提取总RNA

一、试剂与耗材

试剂：Trizol，氯仿（三氯甲烷），异丙醇，75%酒精（DEPC水配置），DEPC水，PBS缓冲液

1、Trizol：

Trizol中含有苯酚（主要物质，裂解细胞）、异硫氰酸胍（解耦剂，可溶解蛋白质并使其二级结构消失）、β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）、8-羟基喹啉（抑制RNase）等物质，可以迅速破碎细胞提取总RNA，同时保证RNA的完整性。

注：Trizol可以裂隙细胞，是一种剧毒物质，千万别接触到皮肤如果不小心碰到，要用大量的去垢剂和清水清洗。

2、氯仿

作为一种有机溶剂，主要用于分相，也有变性蛋白质的作用。可将水相中的苯酚抽提出来，RNA全部溶解于水样中。还可以去除脂溶性杂质。

加入氯仿离心后，EP管中溶液分三层，上层，中间层，下层。 

注：氯仿是一种致癌物质，对心、肝肾有损害，吸入或皮肤吸收均会引起中毒，一定要佩戴手套噢。

3、异丙醇

通过-OH的疏水作用保护RNA链中的亲水基团，即可将RNA沉淀下来。

注：异丙醇具有较强的挥发性，对眼、呼吸道有刺激作用，大量吸入其蒸汽会引起面红、精神抑郁、恶性等症状。

4、75%乙醇

可溶解掉有机物杂质，也可洗掉异丙醇、氯仿试剂。乙醇易挥发，不用太担心残留对RNA的影响。

耗材：20μl、200μl、1000μl的qiang头，100μlPCR管，1.5ml及2ml离心管，qiang

二、提RNA步骤（以六孔板细胞为例）

提前将各耗材放进超净台，照紫外15min

1、 准备6支2ml离心管，作好标记，将六孔板中相应孔中培养液移至2ml离心管中，1000rpm/5min。同时每孔加入1mlPBS，轻轻晃动至覆盖全部细胞表面。（肿瘤细胞加药后有细胞漂浮，所以需要离心培养液，其他情况可忽略这一步）

2、 取出离心结束的2ml离心管，弃去上清，将六孔板中PBS按组别分别加入相应2ml离心管中，1000rpm/5min。同时每孔加入1ml Trizol，室温静置5min。

3、 取出离心结束的离心管，弃去上清。吹打孔板中的细胞，并将吹打结束后的Trizol细胞裂解液转移至相应离心管中，混匀，室温静置5min。

4、 按1ml Trizol 加200μl的氯仿，在每管中加入200μl的氯仿。盖紧盖子，用力震荡15s，在室温下静置10min，待其分层后，于12000g，4℃，离心15min。

5、 小心取出离心结束的离心管，准备新的6支1.5ml离心管，作好标记，用200μl的qiang小心吸取上清至新的相应的离心管中，大约吸400μl就够了，不能贪多，千万不能吸到下面的蛋白质。

6、 按氯仿：异丙醇=1：1的比例加入等量异丙醇，轻轻颠倒混匀，于4℃放置30min，（若是提取miRNA，建议负80冰箱过夜，只要前面操作没有问题，RNA纯度浓度在-80℃过夜不会有太多差别）

7、 将上述1.5ml离心管于12000g，4℃，离心10min。

8、 离心结束可见小小的白色沉淀，弃上清，每管加入1ml75%乙醇进行洗涤，可用qiang轻轻吹打一下，7500g，4℃，离心5min。

9、 取出离心管，弃上清，让沉淀的RNA在室温下自然干燥（在弃上清时，我会将EP管倒扣在干净纸巾上，这样可以减少壁上残留液体，更快干燥）。不能过干或有过多液体残留，干燥结束后，加入20-50μlDEPC水溶解（可根据细胞种类、样本类型调整加DEPC水的量），核酸亲水，会很快溶解于水中。

10、用Nanodrop one仪器测定RNA的浓度和纯度（OD260/280）。