CC0651抑制剂

    CC0651是人类Cdc34泛素结合酶的变构抑制剂。通过剂量 - 反应分析证实，CC0651有效（IC 50 = 1.72μM ）抑制p27 Kip1的泛素化。

    体外

    CC0651强烈损害SCF Cdc4在底物上泛素链起始的速率，通过K1遍在蛋白对Sic1的单泛素化来测量。实际上，CC0651增强了遍在蛋白二聚体和单泛素化hCdc34的形成，与在用CC0651的酯衍生物处理的细胞中观察到的hCdc34缀合物的积累一致。CC0651完全抑制多聚泛蛋白链的组装并减少游离三聚泛蛋白的形成，并且在较小程度上抑制hCdc34单泛蛋白的形成，但对二泛素的产生没有影响。CC0651是E2泛素结合酶Cdc34A的抑制剂，通过捕获遍在蛋白和E2供体遍在蛋白结合位点之间的弱相互作用起作用。使用β-连环蛋白底物肽的定量SCF遍在蛋白化测定对于CC0651抑制产生的IC 50值为18±1μM，类似于在NMR和TR-FRET测定中观察到的有效浓度

    实验参考方法

    激酶测定

    对于小分子筛选，P27 标Kip1被泛素化与40nM的磷酸化的p27，40nM的E1，5μME2，25nM的SCF有15μL反应中Skp2，25nM的CKS1，和27.8μM在40mM的Tris-HCl生物素化的泛素[pH 7.5]，5mM MgCl 2，1mM DTT和0.5mM ATP，在23℃下保持3小时。用测定稀释剂终止反应，转移到涂有62ng SC528抗体的384孔蛋白A板上，温育1小时，并在加入之前用10mM Tris-HCl [pH 7.6]，0.05％Tween20洗涤6次。每孔中HEPES [pH 7.6]，1％BSA，0.2％吐温20中的25μL0.4mg/ mL铕链霉抗生物素蛋白。将板孵育1小时，洗涤，并在加入25μL增强溶液后读取Eu-时间分辨荧光。对于基于凝胶的泛素化测定法，CC0651和它的类似物是在指定浓度预孵育用0.5μgE1，1-4微克hCdc34，和50ng SCF CDC4，100ng的SCF FBW7，150纳克SCF βTrCP，或50纳克SCF Skp2的在4℃下，在20微升反应缓冲液（50mM HEPES [pH为7.5]，10毫摩尔MgCl 10-45分钟2，2毫摩尔ATP，50μM和DTT）。通过加入1μg遍在蛋白和各自的SCF底物（50ng His Sic1磷酸化Cln2-Cdc28,50ng细胞周期蛋白E磷酸化Cdk2,25ng生物素化IκBα磷酸肽[KKERLLDDHDpSGLDpSMKDEE]或50ng p27 Kip1磷酸化细胞周期蛋白E-Cdk2开始反应） ），在30℃下孵育1-3小时，并通过免疫印迹[1]显现产物。

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

    细胞分析

    PC-3和HCT116细胞系在补充有青霉素/链霉素，2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清（FBS）的DMEM中生长。使用用于人CDC34，UBE2R2和非靶标控制的慢病毒shRNA构建体。对于增殖测定，将PC-3培养物以5000个细胞/孔一式四份??接种在24孔板中，生长24小时，然后用慢病毒上清液感染。对于小分子抑制，将细胞以500个细胞/孔接种在96孔板中一式四份，生长24小时，并用化合物处理。通过MTT测定法测量增殖。通过血清饥饿将PC-3或HCT 116培养物在G0 / G1中同步30小时，然后通过添加10％血清释放。对于上位性实验，PC-3细胞被CDC34感染shRNA持续24小时，然后加入抑制剂并在4天后评估增殖。使用抗Cdc34，抗p27，抗α-微管蛋白，抗泛素和抗细胞周期蛋白E抗体。

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

    本文参考来源：https://www.medchemexpress.cn/CC0651.html