非编码RNA的过表达及干扰

1) miRNA的过表达或干扰

通常使用模拟物（mimics），或拮抗剂（inhibitor）即可实现。如需进行动物实验，需要构建并包装腺（相关）病毒。对于miRNA的过表达，慢病毒及腺病毒系统均适用；但针对miRNA的干扰，腺/慢病毒虽然有相关报道，但均不成熟。

2) LncRNA的干扰

为什么lncRNA的干扰总是失败，首先我们明确RNAi技术是发生在转录后的细胞质中的。而lncRNA的转录发生在细胞核内，有的最终表达于细胞质，有的表达于细胞核，有的lncRNA则细胞核和细胞质中均有表达，故而针对lncRNA的干扰是否能成功，首先最需要的是先明确是这个lncRNA的表达定位。核内表达的lncRNA是很难通过shRNA被成功干扰的。先做个细胞核/质分离后的lncRNA表达检测，或者FISH（荧光原位杂交）以明确lncRNA的亚细胞定是必要的，而这点常常被刚涉猎lncRNA研究的人们忽略。

另外，对于LncRNA的基因表达水平的调控可以考虑使用CRISPR/Cas9系统。但是，由于LncRNA是不翻译蛋白的RNA序列，一般通过与相关元件蛋白接合而调控基因表达。在不确定具体的调控位点的情况下，一般的单靶点切割并不一定会导致基因表达水平的降低（在靶向非调控区域的情况下）。此时，建议使用双sgRNA系统，通过同时在两个位点的切割，造成整段或者一段基因组序列的缺失，进而导致转录水平的降低（极致情况下几乎可完全不转录）。

3) circRNA的过表达及干扰

circRNA本身环形结构的特殊性在表达载体构建过程中，一旦设计或操作不当很容易出现不能成环或成环效率不高的问题，还会出现插入缺失碱基等情况出现。目前国内有公司对circRNA的表达载体进行了改造，加入环化表达框架，使环状RNA连入载体后能在体外高效率表达，并保证插入的目的环状RNA片段正确环化。因此如要进行circRNA的过表达，选择合适的表达载体非常重要，另外还需要确保转染后QPCR引物的设计能够有效扩增出环状的RNA，而非线性化的RNA。

circRNA由于它特殊的环状结构，及与线性化宿主基因的同源性，导致经常被无效或错误干扰。首先明确circRNA的siRNA设计原则：

（1）针对外显子环化circRNA本身做敲除，设计backsplice junction位点前后序列并设计siRNA（靶点必须跨backsplice junction位点）；

（2）内含子环化circRNA，设计backsplice junction位点前后序列并设计siRNA，或针对内含子区进行siRNA设计（靶点不一定跨backsplice junction位点，但是最好跨backsplice junction位点）；

（3）每个siRNA需要设置对照，backsplice junction位点一段互补配对，另一段错配。

同时circRNA的QPCR引物设计也需要进行跨环设计，以避免非特异性扩增到线性宿主RNA。

另外，如果是外显子成环，可以考虑成环因素（一般是在内含子中），特异性地靶向导致成环的内含子，使其成环受阻，也可以特异性地做到cirRNA的敲除。

另外非常重要的一点，也是常被研究者们忽略的一点，即对circRNA设计siRNA主要考虑的因素还有避免干扰到线性宿主基因。如由于线性化的宿主基因被错误干扰后导致了细胞功能的改变，无法说明是circRNA的功能，即便设计的siRNA靶位点是针对circRNA的。在下游的检测实验中，也需要对线性化的mRNA进行消化，以保留环状RNA。

如何避免设计的siRNA与线性转录本发生结合，遵循这三条原则：

（1）Binding site at the head-to-tail junction；（siRNA需绑定到circRNA环的首尾链接处）

（2）7-mer seed not present in the linear host gene;（最好有7个碱基没有在线性宿主基因出现）

3） chemical modifications within the seed region.（在靶点区域有化学修饰，以避免似于miRNA效应的影响）