浅谈艰难梭菌和它的检测

艰难梭菌以前不被重视, 这两年逐渐成为院感的一个热门话题。也借这个平台把一些零散的学习和总结和大家分享，有说的不对的地方，也希望大家不吝指正。

１．艰难梭菌是啥？

艰难梭菌全称难辨梭状芽孢杆菌，英文名Clostridium difficile，　简称“C. difficile”或“C. diff”是一种自然产生的革兰氏阳性菌。梭状芽胞杆菌是一种厌氧芽孢杆菌(bacilli)，分布广泛，常存在于土壤中。在显微镜下，梭状芽胞杆菌表现为形状不规则(通常为“鼓槌”或“纺锤”型)的长细胞，一端带有凸起。

艰难梭菌可以定植在正常人的肠道内，但是只有1~3%的成人才有，但是在大多数健康的婴儿内都有定植（但通常最多只能维持定植1-2年时间)。为什么呢？因为正常人的肠道菌群丰富，有乳酸杆菌，双歧杆菌，肠球菌等会对艰难梭菌有拮抗（抑制）作用。

２．感染患病机制？

我们常说的艰难梭菌感染，英文Clostridium difficile infection, 简称CDI.

艰难梭菌既然可以正常定植人类肠道内，是条件致病菌，只有在1. 肠道菌群失调后产生增殖，2. 产生毒素（因为有的菌株产毒素，有的不产毒素，很“随性”）。

那什么时候肠道菌群会失调呢？比如服用抗生素啦～这也是为啥CD在医疗相关性腹泻中占到15~25%,并且是抗生素相关肠炎的主要原因（Bartlett JG,2002)

 那产生什么样的毒素呢？目前研究发现，CD菌株会产生毒素A/毒素B/二元毒素CDT。最常见的是毒素A/毒素B。一开始研究认为毒素A是肠毒素，毒素B是细胞毒素（现在也有发现B有肠毒性，且B有一个有效的自加工过程，毒力是A的1000倍），大多数艰难梭菌种属都产生这两种毒素，在初期外毒素A首先与黏膜细胞绑定，造成初级的破坏，然后外毒素B进入组织细胞而发挥更大的破坏，导致结肠炎，伪膜形成和水性腹泻。

可怕的是后来在严重的CDI中发现有的菌株还会分泌二元毒素CDT，这是个毒力增强因子，可以增加毒素A和毒素B的分泌。

2000年后，欧美国家发生了CDI爆发，有关研究认为主要是高毒力的菌株引起，目前核糖型027，078和017型是医院暴发流行的主要高毒力菌株。

3. CDI的发病率和死亡率？

先看国外的流行情况：从2000年起，CDI发病率显著上升，在美国，加拿大和欧洲都有暴发流行。并且CDI可能是美国目前引发急性腹泻最常确诊的细菌因素(Du-Pont et al., 2011)。2008年，据估计，可能有一百万例CDI发生在美国(Dubberke et al., 2012)。2010年，一项研究表明，第一次，医疗相关性的CDI超过了MRSA感染在多个州的28个社区医院，CDI发生率比MRSA高出25%(Miller et al., 2011)。

在美国，C. difficile感染可导致14000人/年的死亡。在2000到2007年之间，与C. difficile相关的死亡增加了400%，一部分原因是更具有致病性的菌株027的传播日益增加。与CDI相关的90%死亡病例发生在65岁或者年纪更大的患者中(CDC生命体征报告，2012年3月)。在欧洲和北美， 一项近期综述发现，30天时的死亡率较高，达到9-38%，超过15项研究报告死亡率为15%或更高(Mitchell et al., 2012)。

国内近年也有关于CDI流行病学的研究，但都是个别区域，没有大面积的研究（待补充）

可参考Clostridium difficile infections in China，2013

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3596688/

4. 艰难梭菌感染的临床诊断？

首先我们看看CDI的临床症状有哪些？

CDI和其他胃肠道感染很相似，如

• 水性腹泻（每天>３次）(除了肠梗阻是固体便)

• 发烧

• 下腹部绞痛

• 恶心

• 腹胀

• 粪便中可能会出现粘液或脓液(极少情况下出现血液)

主要的难辨梭菌相关疾病是伪膜性肠炎(PMC)，中毒性巨结肠，结肠穿孔。临床上，约15%-25% 的抗菌药物相关性腹泻( antibiotic associated diarrhea，AAD) 、50% ～ 75% 的抗菌药物相关性结肠炎和95% ～ 100% 的伪膜性肠炎( pseudomembranouscolitis，PMC) 是由CDI 引起。

伪膜性肠炎临床表现为发热，腹痛，恶心，腹胀，大量腹泻，腹泻物呈绿色海水样或黄色蛋花样稀便，脱落的伪膜。腹泻后腹胀减轻，脉搏增快，血压下降，呼吸急促，脱水征象，精神错乱，腹部压痛，腹肌紧张，肠胀气及肠鸣音减弱。腹泻是最主要的症状，多在应用抗生素的4～10天内，或在停药后的1～2周内，或于手术后5～20天发生，腹泻程度和次数不一，轻型病例，大便每日2～3次，可在停用抗生素后自愈，重者有大量腹泻，大便每日可30余次之多，有时腹泻可持续4～5周，少数病例可排出斑块状伪膜，血粪少见。

再看看哪些是感染的高危人群？　

• 服用抗生素的人（长期暴露于广谱抗菌药物，尤其是克林霉素、氟喹诺酮类和第三代头孢菌素患者）

• 老年人(＞65岁)

• 有严重基础疾病的人

• 使用免疫抑制剂或免疫低下，免疫缺陷的人

• 长期使用质子泵抑制剂和抗组胺剂（如H2受体阻滞剂）的人

• 特别注意胃肠手术后合并使用广谱抗菌药物的患者发生风险最高。

知道了危险因素和高危人群后，我们来看看如何进行实验室诊断鉴别CDI与普通的胃肠道感染？

CDI 诊断标准为：患者出现中至重度腹泻或肠梗阻，并满足以下任一条件：( 1) 粪便检测CD 毒素或产毒素CD 结果阳性； ( 2) 内镜下或组织病理检查显示伪膜性肠炎。

传统的CDI诊断方法是细胞毒性试验( cell cytotoxicity assay，CCTA)，即细胞毒性中和试验( cell cytotoxin neutralization assay，CCNA), 用于直接检测粪便标本中存在的CD 毒素， 是CDI金标准, 特异性强，敏感度高( 最低可检测出10 pg 毒素) ，但需要细胞培养及显微镜观察的相应设施和技术，操作繁琐，耗时长( 48 ～72 h) ，判定结果需要一定经验的技术人员，不适宜临床常规检测。

CCTA具体操作：将不成形稀便标本离心，上清经0. 45 μm 滤膜过滤，将无菌PBS 稀释的粪便滤液加入细胞悬液( Vero 或Hep2 细胞等) ，分别加入和不加入抗CD 毒素的中和抗体，37 ℃ 5% CO2环境培养，24 h、48 h 后显微镜下观察细胞病变效应( cytopathiceffect，CPE) ，而加入特异性抗毒素抗体能阻止这种细胞病变。

除了金标准CCTA法外，实验室参考方法还有产毒素培养( toxigenic culture，TC) 用于检测CD菌株的产毒素能力， 该方法敏感度高，特异性强，但操作繁琐，耗时长( 5 d 左右) ，结果判读的技术人员需要有一定经验，不适宜临床常规检测，可用于流行病学监测，并作为评价其他检测方法的参考标准。

TC具体操作：将不成形稀便标本接种于CCFA培养基（环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基，是难辨梭菌选择培养基）或CD 显色培养基上，37 ℃厌氧培养至少48 h，挑取典型菌落接种至液体培养基中，厌氧培养48 h，0. 45 μm 滤膜过滤培养上清进行细胞毒性试验。也可用免疫法检测固体培养基上菌落产毒素能力，检测时间可缩短至2 ～ 3 d，但敏感度稍低。

可以看到细胞毒性试验和产毒素培养都操作繁琐，耗时长，所以指南推荐使用两步法或三步法进行CDI 诊断。( 1) 三步法:即首先使用GDH 试验初筛，GDH 阳性进行毒素EIAs 试验，二者结果不一致使用CCTA、TC 或NAATs 确证( 图1) 。( 2) 两步法：即同步联合检测GDH 和毒素EIAs 试验，二者结果不一致使用CCTA、TC 或NAATs确证( 图2) 。

图1：三步法

图2：两步法

其他相关实验室检查

轻至中度感染患者外周血白细胞可正常，严重感染者白细胞可达15 × 109 /L 以上。血清降钙素原( procalcitonin，PCT) 对诊断CDI 意义不大，但PCT＞ 0. 2 ng /ml时，提示CDI 有重症化趋势。合并脓毒血症时，相应脏器损害的功能指标也异常，如血肌酐超过正常值1. 5 倍，血清白蛋白＜ 2. 5 g /L。

CT 检查对于诊断CDI 缺乏特异性和敏感度。若发现结肠壁增厚、结节状结肠袋增厚、水肿厚度＞ 4 cm，特别是炎症部位在升结肠时，对于重症CDI感染患者有一定辅助诊断意义。暴发性CDI 常出现腹水、缆绳征等。

内镜检查为诊断CDI 的重要手段之一，尤其在病原学依据缺乏或难以与其他炎症性肠病相鉴别时。典型内镜下特征表现为伪膜性病变，主要征象包括黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡、直肠乙状结肠有多发性隆起的斑片或融合为大片的灰绿色、黄褐色伪膜覆盖黏膜表面； 严重者病变融合； 伪膜邻近的黏膜可呈水肿、充血，触及易出血，也可见散在溃疡； 伪膜性病变主要累及左侧结肠或全结肠，少数累及回盲部。部分CDI 患者内镜下表现可不典型，尤其炎症性肠病合并CDI 时多无特征性伪膜性病变。内镜活检组织检查无特异性诊断价值，病理结果常提示为非特异性结肠炎。

5. CDI的治疗

中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识中写到：

轻-中度感染：CDI 患者有腹泻等肠炎样症状，但没有重症感染表现。给予甲硝唑500 mg ( 口服或胃管入) ，每8 h 一次。

重症感染：CDI 患者有腹泻，且存在以下任何一项因CDI 导致的异常：白细胞＞ 15 × 109 /L、血肌酐较基线升高＞ 50%、内镜发现伪膜。给予万古霉素125 mg 溶液( 口服或胃管入) ，每6 h一次。

重症感染伴并发症：CDI 患者符合重症感染诊断标准，且存在以下至少一项因CDI 导致的异常:低血压、肠梗阻、中毒性巨结肠或弥漫性结肠炎、肠穿孔、需结肠切除、因CDI 入住重症监护病房治疗。首先需外科、感染内科医生会诊，评估结肠切除手术指征； 给予万古霉素500 mg，每6 h 一次，配伍甲硝唑500 mg ( 胃管入) ，每8 h 一次； 患者一旦病情稳定，万古霉素即应减量至125 mg，每6 h 一次，同时停用甲硝唑； 口服给药受限或完全性肠梗阻的患者，可经Foley 导管给予万古霉素500 mg ( 溶于100 ml生理盐水) 直肠保留灌肠每6 h 一次，配伍甲硝唑500 mg，静脉输注，每8 h 一次，该项治疗存在结肠穿孔的风险。

复发性CDI：即使完成疗程的CDI 患者，仍有20%左右的复发可能，其原因并非对甲硝唑或万古霉素耐药，而是芽孢清除失败或感染了新的CD。第一次复发时仍可采用原治疗方案； 第二次复发时应给予万古霉素并逐渐减量，配合脉冲式给药模式或粪便菌群移植。万古霉素减量方法：125 mg，4 次/d，10 ～ 14 d； 125 mg，2 次/d，7 d； 125 mg，1 次/d，7 d； 125 mg，1 次/2 ～ 3 d，2 ～ 8 周。