【讨论】 条件性基因剔除(conditional gene knock out)

应gaalaa主任之约，以Journal club方式讨论、介绍条件性基因剔除(conditional gene knock out)技术及应用。现将文章附上，随后介绍条件性基因剔除。欢迎大家参与讨论。
Requirement for Hippocampal CA3 N M D A Receptors in Associative Memory Recall
Kazu Nakazawa,etc SCIENCE VOL 297 12 JULY 2002
Pattern completion, the ability to retrieve complete memories on the basis of incomplete sets of cues, is a crucial function of biological memory systems. The extensive recurrent connectivity of the CA3 area of hippocampus has led to suggestions that it might provide this function. We have tested this hypothesis by generating and analyzing a genetically engineered mouse strain in which the N-methyl-D-asparate N M D A receptor gene is ablated specifically in the CA3 pyramidal cells of adult mice. The mutant mice normally acquired and retrieved spatial reference memory in the Morris water maze, but they were impaired in retrieving this memory when presented with a fraction of the original cues. Similarly, hippocampal CA1 pyramidal cells in mutant mice displayed normal place-related activity in a full-cue environment but showed a reduction in activity upon partial cue removal. These results provide direct evidence for CA3 N M D A receptor involvement in associative memory recall。

基因转移的方法介绍，以鱼类为例 http://www.biox.cn/content/20050414/10459.htm
2．1 显微注射法
显微注射法是目前广泛使用、效果较好的一种鱼类基因导人方法，其主要 程序如下：(1)人工催情，分别收集鱼的卵子和精液，体外人工受精；(2)受精后3～5min，用0．25％的胰蛋白酶消耗以去除卵壳，将裸卵移入盛有 Holtfreter氏培养液的平面皿中；(3)将溶于ST(88mMNaCl、10mMTris—HCl，pH7．5)溶液中的外源基因装人玻璃微针， 在第一次卵裂前实施外源基因的显微注射手术。每卵注射1—2nL的DNA溶液，约含1×106拷贝的外源基因；(4)显微注射后，受体卵在 Holffreter氏溶液中培养发育。胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释；发育至心跳期后，将胚胎转移到暴气的冷开水中直至形成鱼 苗。在胚胎发育过程中，需精心管理，及时去除死胚胎。
上述方法主要适用于一些卵壳易被胰蛋白酶消化的淡水鲤科鱼类。对于一些冷水性的鲑鳟鱼类来 说，胰蛋白酶消化难以去除卵壳。因此发展了3种变通的显微注射方法。一是从受精孔将DNA溶液注入卵中，简称MP法；二是在虹鳟受精卵刚受精后卵壳尚未变 硬时直接注射，简称EL法；三是先用硬金属针在卵壳上打一个孔，再进行显微注射，简称LI法。
2．2 电脉冲法
电脉冲进行鱼类受精卵基因 转移的前两步与显微注射法相同。不同的是将胰酶消化后的裸卵与外源DNA溶液一同放人一特制的电脉冲处理槽中，然后施加一定强度的电脉冲。外源DN在电脉 冲处理下进入受精卵。这一方法的优点是操作比较简单，可同时处理大量的受精卵。缺点是导人无定向、效率较低，针对不同种鱼需要建立相应的电脉冲条件等。
外 源基因在电脉冲处理条件下进人受精卵的机制尚不十分清楚。在已成功的鱼类电脉冲基因转移报道中，使用的电压都较低(几百伏)。有人认为，在这样的电压下， 不足以使受精卵膜发生变态或产生小孔。因此，外源基因的进入机制也就不同于培养细胞，推测是在鱼类受精膜上天然存在一些小孔，在低电压下，外源基因就通过 这些小孔进入受精卵。
2．3精子携带法
精子在等渗液中先与外源基因保温，可将外源DNA片段带人精子细胞内，再与卵子受精，可将外源 DNA片段带人受精卵内。该方法简单、方便，依靠生理作用受精，对原核损害较小。此法已在鲤鱼、泥鳅[5l中试验成功，目前已有6种鱼的成功报道。其外源 基因的处理方法虽各有不同，但都得到分子杂交或PCR检测的阳性结果，阳性率在5％～38％。从总的实验结果来看，精子携带基因转移尚存在转基因阳性率 低、转移率不稳定现象。此外，精子携带外源基因的机制尚未明确，推测与精子表面吸附或精子细胞摄取有关。
2．4基因*注射法
基因*注射法 是通过把吸附DNA的金属微粒高速打人细胞内，使基因导入细胞内的方法。有人在泥鳅、斑马鱼、鲑鱼的3日胚上应用此法，结果70％的个体生存，一部分个体 导入了外源基因。此法不容易进行，但有短期可处理多个个体的优点，只是现在的报道太少，有待今后进一步的研究。
2．5 逆转录病毒感染法
此 类病毒是RNA病毒的一种，进入宿主后从RNA逆转录成DNA，并结合到宿主细胞的染色体上，这种纳入病毒基因的细胞染色体内就存在了病毒基因。如果把目 的基因组合到病毒染色体上，用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞内导人外源基因17J。但转基因因病毒有严格的宿主特异性，而且鱼类转基因病毒的分析 非常落后，对于鱼类此法暂不太适用。
2．6组织注射法
有报道外源基因向体组织直接注射时，周围细胞把外源基因纳人，并且发现了那种外源基 因。有人把CAT(链霉素转移酶基因)注射到一些鱼的体侧肌肉上，从肌肉匀浆中检测出CAT活性”。另一方面，把含有合成黑色素的互补DAN质粒注射到一 些鱼的体侧肌肉上，使周围体表合成黑色素，体表黑化。这种方法能非常容易地把外源基因导人细胞内，所以对检测外源基因启动子非常有效。
2．7 卵母细胞的基因转移
选取、收集、准备发育到一定时期的卵母细胞，显微镜下检查胚泡，若卵可供注射，操纵注射管，扎进胚泡进行显微注射，即将外源基因准确地注入卵母细胞核中，离体培养卵细胞至成熟卵，然后与正常精于受精，使受精卵整合外源基因，发育成转基因鱼。
2，8基因打靶法
20 世纪90年代出现了新的外源基因导入技术，即基因剔除(gene knock out)和基因楔入(geneknockin)技术。基因剔除是基因打靶的(genetargeting)一种方法，类似于同源重组技术，指外源DNA与 受体细胞基因组合，这是一种先进的传染技术，克服了其它传染技术无法消除的盲目性和偶然性，具有整合位点确定、精确、转移基因频率较高等优势，但是基因剔 除技术不能产生核苷酸水平上的精确突变，新的挑战使条件性基因剔除(conditional gene knock out)应运而生，这是基因剔除技术的一个飞跃。它是指在某一特定的细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术，常采用打了就走(hit and runstrategy)、标记—交换(tag and exchange strategy)和Cre—loxP重组系统(Cre—lox P recombina-tion system)等新的转基因策略，这些新策略可对细胞中任一基因进行核苷酸水平上的精确突变。
基因楔入又称基 因置转技术(gene replace•menttechnique)，使双链的断裂点发生在同源序列的边缘或同源序列之外，转基因的结果是外源DNA取代内源靶序列，虽然基因 楔人技术刚刚起步，但已经展示了它在应用研究方面的广阔前景。以上介绍的几种基因打靶方法大大提高了外源基因的整合率，但是未能解决外源基因定点整合的问 题。小鼠ES细胞基因打靶技术可以获得对某一位点上基因进行改造的同合子个体。该技术首先把含有更改好的基因或基因的一部分插入到载体，并引入来自小鼠的 ES细胞系，ES细胞能进行组织培养，并能产生任何组织的细胞，细胞增殖一段时间后，筛选出发生同源重组的少数细胞进行克隆并扩增，然后用显微毛细管将细 胞注入小鼠早期胚胎，产生嵌合体。若该嵌合体在生殖细胞携带外源基因，则其后代中1／2为转基因个体，它们相互交配，后代中1／4为携带外源基因的同合 子，即为可用于研究的转基因个体。然而该技术的应用必须依赖于ES细胞，而ES细胞只能在小鼠上获得，故该技术只能局限在小鼠上展开。如何在大动物上做到 外源基因的定点整合是研究人员一直努力的方向。