如何防止眼球冰冻切片脱片？

我做的是大鼠眼球冰冻切片，用于做免疫荧光，上一个二抗，染个核就够了。步骤如下：

1.   将组织直接液氮包埋后切片，室温放置2h，

2.   冰丙酮固定30min，

3.   冰PBS浸泡3遍*5min

4.   滤纸吸干后加5%山羊血清，入湿盒室温封闭1h

5.   冰PBS洗一遍

6.   滤纸吸干后1%Triton 20min

7.   冰PBS浸泡3遍*5min

8.   滤纸吸干后滴加二抗，室温孵育1h,

9.   冰PBS浸泡3遍*5min

10. 滤纸吸干后DAPI染色30min

11. 冰PBS浸泡3遍*5min

12. 滤纸吸干后滴加甘油，用指甲油封片

这样处理过的片子，虽然二抗有上去，但我需要的角膜组织都脱片了（后极部没脱），**大神帮忙看看脱片原因，是不是因为片子被PBS泡太久了？顺便求不脱片的办法！！！

 第二次做采取4%多聚甲醛固定后去晶体再包埋的方法，想问样品在冰冻切片后该如何处理？由于切片时间长，先切好的片子是直接泡PBS还是电吹风吹干后密封放-20保存？