化学诱导的急性和慢性小鼠肠炎模型的构建—更新方案

原创 2017-06-12 订阅号APExBIO

炎性肠病（IBDs）如克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）的特征是慢性腹泻和腹痛。然而，随着时间的推移许多患者发生严重并发症，如组织纤维化，狭窄，瘘和结肠癌。动物模型有助于了解IBDs的免疫发病机制和新型治疗方案的设计。在这里，作者Wirtz等介绍了其在2007年发布的关于2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），恶唑酮（oxazolone）和硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的急性和慢性结肠炎模型的更新实验方案。论文在线发表在《Nature Protocols》。

TNBS结肠炎。在该模型中，通过直肠内给予半抗原物质TNBS和乙醇，在易感性小鼠品系中诱导结肠炎症。乙醇是损害屏障功能，允许TNBS渗透肠壁的关键。TNBS给药导致结肠或微生物蛋白衍生蛋白的半抗原化，随后导致TNP特异性CD4 + T细胞和抗体的产生。由于该模型与高活性T细胞的增加相关，因此T细胞在TNBS结肠炎中具有关键的致病作用，该模型适用于确定发炎肠道中的CD4 + T细胞依赖性免疫。先天性免疫机制也参与TNBS结肠炎的发展。炎症过程的强度和长度在很大程度上取决于几个因素，例如小鼠的遗传背景以及当地动物设施中T细胞活化细菌菌株的存在与否。因此，每个小鼠系和每个设施中TNBS给药的个体优化是必不可少的。

恶唑酮结肠炎。恶唑酮是一种半抗原试剂，在小鼠内直肠给药后引起严重的结肠炎。远端结肠粘膜和粘膜下层的急性炎症的特征在于嗜中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的溃疡和固有层浸润。虽然SJL / J和C57BL / 10小鼠是高度敏感的品系，但是C57BL / 6小鼠对恶唑酮结肠炎更具抗性，并且可能在直肠内给药之前需要皮下致敏步骤。该模型已被用于研究肠道炎症期间的2型和9型相关免疫应答。重要的是，较低剂量的恶唑酮也可能诱导混合的Th1 / Th2反应，在每种小鼠品系中，恶唑酮结肠炎需要单独的优化策略。

DSS结肠炎。通过饮用水将硫酸多糖DSS以口服方式给予小鼠，导致以体重减轻，血性腹泻，溃疡形成，上皮细胞丧失和嗜中性粒细胞浸润为特征的严重结肠炎。该模型已被用于探究微生物群对结肠炎发展的影响，及导致微生物群组成变化的因素（如饮食因素）。例如，有研究已经表明，缺乏炎症性蛋白质NLRP6的小鼠更容易发生DSS结肠炎。基于其简单性和重复性，剂量和治疗周期的修改允许模拟急性，复发和慢性肠炎症形式，以及分析上皮损伤时重复的组织再生和慢性伤口愈合。

实验方案设计：

图▲ 由TNBS，恶唑酮和DSS诱导的急性和慢性鼠结肠炎模型的最新方案

A）急性TNBS结肠炎的诱导。10–14天。

预敏化: 麻醉小鼠, 使用电动剃刀在背面肩膀之间皮肤刮1.5×1.5厘米的面积，防止动物舔该区域。舔可能潜在地诱发口服耐受。使用移液管将150μl 1％（wt / vol）TNBS预敏化溶液施用于剃光皮肤区域。TNBS应迅速被皮肤吸收。

注意：在第8天称重小鼠。跟最初相比，这个时间点实验小鼠的体重不应该变化很大，如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。

结肠内腔注射浓度：2.5％（wt / vol）TNBS，100μl。

B）慢性TNBS结肠炎的诱导。45–49天。

预敏化同A。

将100μl的0.75％（wt / vol）TNBS溶液慢慢注射到结肠的内腔中。

在第15天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。

注射100μl的1.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第22天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。

注射100μl的2.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第29天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。

注射100μl的2.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第36天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。

注射100μl的2.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第43天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。

C）急性恶唑酮结肠炎的诱导。10-14 天。

预敏化: 同前。使用移液管将150μl 3％（wt / vol）恶唑酮预敏化溶液施用于剃光皮肤区域。恶唑酮应迅速被皮肤吸收。

注意：在第8天称重小鼠。如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。

结肠内腔注射浓度：0.5-1％（wt / vol）恶唑酮，100μl。

D）慢性恶唑酮结肠炎的诱导。36-42 天。

预敏化同C。

在第6天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。

将100μl 0.5％（wt / vol）恶唑酮溶液慢慢注入结肠的内腔—在第20天，称小鼠的体重—注射100μl 0.5％（wt / vol）恶唑酮溶液——在第34天，称小鼠的体重—注射100μl 0.5％（wt / vol）恶唑酮溶液。

E）急性DSS结肠炎的诱导。8-14 天。

第1天每只小鼠给予5ml DSS溶液（浓度均为2%）—在第3天，清空瓶子并测量剩余的DSS溶液—用新鲜的DSS溶液（每只小鼠每天5ml）填充瓶子—在第5天，清空瓶子并测量剩余的DSS溶液—用新鲜的DSS溶液（每只小鼠每天5ml）填充瓶子—在第8天，清空瓶子并测量剩余的DSS溶液——用灭菌自来水填充瓶子。

F）慢性DSS结肠炎的诱导。时间 52-56 天。

同E—在第22-26天，同E—在第43-47天，同E。

G）结肠炎相关结肠直肠癌的诱导。时间52-77 天。

注射小鼠i.p.，10 mg / kg AOM溶液—同F。

具体实验步骤见文献（P5-P11）。步骤1和10-14是2007版本上的更新步骤。

虽然这些实验步骤很容易操作，但是有些因素对疾病的结果有很大的影响，如小鼠近交系的遗传异质性和动物设施的局部微生物群等。尤其是肠道微生物群体的组成差异，即使在同一动物设施中，也可能大大影响疾病预后。因此，实验中所有组的小鼠应该具有共同的来源。当比较野生型和转基因小鼠之间的结肠炎易感性时，强烈建议使用同窝出生者。此外，可通过实验小鼠的并笼饲养，平衡微生物群，来减少笼养效应（图2）。

图▲ 通过并笼平衡微生物群

如同人类的许多自身免疫性疾病一样，性别差异导致的结肠炎易感性是存在的，必须加以考虑。例如，在DSS结肠炎中，雄性小鼠往往比雌性小鼠更易感。不同生产批次的结肠炎诱导物质存在很大差异，因此新批次可能需要更新剂量优化。由于TNBS，DSS和恶唑酮诱导剂量依赖性肠损伤，高剂量可能导致大量死亡率（结肠炎，坏死和结肠穿孔导致）。相比之下，不足的低剂量可能导致短期，弱或甚至完全没有结肠炎活动。

C57BL / 6是最广泛使用的小鼠近交系，作者提供的急性结肠炎方案显示中度至高度的急性DSS结肠炎。根据经验，饮用水中DSS浓度为2-3％（wt / vol），饲养7天，在C57BL / 6小鼠中引起明显的结肠炎，死亡率低（与2.5-5％Balb / c小鼠相比）。然而，也有研究者在更短的时间内使用更高的DSS浓度（例如3-5％，5天）。此外，在C57BL / 6小鼠中可以通过2-3％DSS的三个循环（7天的DSS诱导，14天的水）诱导长期持续的慢性结肠炎。相比之下，与SJL / J和Balb / c小鼠相比，C57BL / 6系对TNBS依赖性结肠炎症相当耐药。然而，如本文所述，如果该方案中包含TNBS的预敏化步骤，则该系也表现出显着的TNBS结肠炎。为了建立慢性TNBS和恶唑酮结肠炎，在迄今为止进行的大多数研究中，使用了Balb / c小鼠。然而，这里提供的慢性TNBS方案也适用于C57BL / 6小鼠。 C57BL / 6小鼠对恶唑酮结肠炎更敏感，需要较低剂量才能达到最佳效果。重要的是，在急性模型中更是如此，必须非常仔细地优化给药，以防止过度死亡。在慢性恶唑酮结肠炎中，可以重复施用相同的恶唑酮浓度，在慢性TNBS结肠炎中，剂量递增策略在几项研究中证明是成功的，以诱导严重的纤维化疾病。

化学诱导的结肠炎模型相对容易和快速地建立并且可以与野生型小鼠一起使用。因此，这些模型已广泛用于筛选潜在的治疗物质。急性模型的优势在于它们是基于短期阻隔性改变，先天性免疫效应和耀斑的分析。慢性模型的优点是可以更好地了解适应性免疫和并发症如瘤形成和组织纤维化。总体而言，多种实验模型的结肠炎可能会复制人类IBDs亚型的方面。没有单一的实验结肠炎模型模拟人类IBDs的所有方面。

参考文献：

1. Wirtz S, Popp V, Kindermann M, et al. Chemically induced mouse models of acute and chronic intestinal inflammation[J]. Nature Protocols, 2017, 12(7): 1295-1309.

2. Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, et al. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation[J]. Nature protocols, 2007, 2(3): 541-546.