请教CE-SDS和SDS-PAGE分析蛋白纯度的差异
CE-SDS和SDS-PAGE都是用于检测蛋白纯度的电泳方法,药典也都有记载,算很常规的操作。但是最近我在做一个蛋白(无糖基化)纯度分析时就发现了这么个问题。
还原(红色)和非还原(蓝色)CE-SDS结果见下图,我这里已经把蛋白提高到20 g/L,最终上样的浓度是5 g/L。积分下来纯度都是100%,出峰时间几乎一样。也就是说,还原和非还原分子量一样,而且没看到杂带。
下面这个是SDS-PAGE结果,从左到右依次为3个还原操作,Marker,3个非还原操作。点样浓度10ug/孔。胶浓度10%。
两个一对比就发现问题了,第一CE-SDS的纯度是100%,是怎么改积分参数都没有其他峰积出来,而SDS-PAGE结果扫描软件就能扫到杂带,非还原有部分聚体,还原有一些低分子量的。第二是SDS-PAGE怎么非还原的分子量要比还原的要小?而CE-SDS是两个出峰时间是一样的。
针对第一个问题,这是CE的灵敏度没有SDS-PAGE高吗?还是SDS-PAGE的杂带是前处理反应产生的?因为这个方法也经常跑其他单抗项目的CE-SDS,NGHC和HC这种分子量只差几道尔顿的都能分离,SDS-PAGE得到的杂带比主条带都要差10道尔顿以上了,理论上对CE应该是能分离出来的。
针对第二个问题,我这边前处理条件都是一样的,仅仅是buffer不同,CE-SDS用的是贝克曼里面的buffer,SDS-PAGE的loading buffer是根据药典配的。这些参数和buffer平时跑单抗没什么问题的,分子量都是对的,杂带也基本和CE-SDS对的上。而这次SDS-PAGE只有还原条带分子量和理论是一样的,非还原条带少了将近10道尔顿。
请教群里各位大神,这怎么解释,我该信哪个的结果?
最后编辑于 2018-01-27 · 浏览 3.3 万