求助大鼠肝星状细胞的分离（PERCOLL法）--未见星状细胞的梯度分层
做实验前我也查了中英文文献，丁香园的帖子也爬上来看了好多。实验我做了好几遍，因为没有师兄姐带着，全是自己摸索，但是均没有见星状细胞的梯度分层，完全不知道问题出现在哪里，把自己的protocol发上来，求大家指导一下。
(1)前预先准备的试剂及配制方法:
1.戊巴比妥钠：30mg溶于10ml D-Hank‘s 配成 3mg/ml工作溶液，（1ml/100g 体重）
2.IV型胶原酶:称取0.025g溶于50ml D-Hank‘s液中，配成0.05%的工作溶液。过滤灭菌。现配现用。
3.链酶蛋白酶Ε:称取 0.05g 溶于 50ml D-Hank‘s液中，配成 0.1%的工作溶液。过滤 灭菌。现配现用。
4.DNaseI酶液:称取0.002g溶于50ml D-Hank‘s液中，配成0.004%的溶液，过 滤灭菌，每 10ml 分装一管，-20°C储存备用。
5. 0.85%的氯化钠溶液: 取 0.1275 g 氯化钠溶于 15ml 双蒸水配制成 0.85%的氯化钠溶液，过滤灭菌。
6. 8.5%的氯化钠溶液: 取 0.85g 氯化钠溶于 10ml 双蒸水配制成 8.5%的氯化钠溶液，过滤灭菌。
7. percoll 等渗液的配制(SIP): 取 9 份 percoll 溶液与 1 份 8.5%的氯化钠溶液充分混合达到生理性渗透压
8. 60%工作液:取6份percoll SIP液与4份0.85%的氯化钠溶液充分混合，现配现用。
9. 40%PERCOLL 工作液:取 4 份 percoll SIP 液与 6 份 0.85%的氯化钠溶液充分混合，现配现用。
(2)原位肝灌注的具体方法:（ps：因为实验室没有灌注的设备，我是用50ml注射器自己推注的）
1.实验动物的术前处理: SD 大鼠实验前 8h 禁食禁水。实验前经大鼠腹腔麻醉，按每 100g 体重注射 1ml 的 3mg/ml戊巴比妥钠。
2.将大鼠仰卧固定于泡沫板上，用75%酒精消毒腹部皮肤 1 遍，于大鼠腹部作一纵行切口充分暴露腹腔。
3.肝门的解剖及肝灌注:将大鼠腹腔内肠管用纱布包裹推向大鼠左侧，充分暴露 肝脏及肝门区，钝性分离门脉系统 ，用 5.5头皮静脉针穿刺门静脉，动脉夹固定。
4.随即剪破心脏作为流出道，用Hank‘s平衡盐溶液溶液以 5～7ml/min 的速度推注约 10min。
5.待肝脏变成黄色，继续用 含 0.05% IV型胶原酶溶液以 2-3ml/min 的速度推注约 15min，继而用含 0.1% 链酶 蛋白酶 E 溶液以 2-3ml/min 的速度推注约 15min。
6.此时可见肝脏呈淡黄色体积明显增大， 质地异常柔软，肝条索模糊不清，肝实质好似与肝包膜分离，停止灌注。
(3)获取肝星状细胞及密度梯度离心
1.将灌注完毕的肝脏分离大鼠腹腔，放入一无菌平皿内。用眼科镊轻轻撕碎肝脏，剔除肝包膜及 Glisson 鞘等组织，加入Hank‘s平衡盐溶液重悬。将肝组织细胞悬液移入两个个 50ml 无菌离心管，加入 25ml 消化酶液体，37°C摇床 20min。
2.然后将组织细胞悬液经 200 目细胞筛过滤 2 次，然后将细胞悬液分装至 4 个 50ml 离心管，补足Hank‘s平衡盐溶液至各管终体积为 40ml，以 500rpm 离心 10min，4°C， 去除大量肝细胞。
3.弃沉淀获得肝间质细胞悬液，以 1500rpm 离心 10min，4°C，获得肝间质细胞。弃上清液，用 DMEM 完全培养基重悬细胞，反复轻柔吹打，充分混匀。
4.取 15ml 离心管 2 支，各加入 3ml 60% percoll 工作液，上覆 3ml 40% percoll 工作液， 最后上覆细胞悬液，注意不同密度 percoll 工作液的添加过程中要匀速缓慢，避免密度层次不清，影响后续密度梯度离心的结果。
5.以 2500rpm 离心 20min，4°C。离心后可见 60%与 40% percoll 工作液之间的淡黄色细胞带即为目的细胞 。
上面的图是文献上的结果。
下面的图是我做的，但是就缺了星状细胞的那层淡黄色分层。
每次的结果都是这样，**帮忙，求指导。
