【交流】 细菌室室内质控

一、药敏试验质控
药敏试验应严格按NCCLS规定的培养基、操作方法、药敏纸片和判定标准进行。为了监控试验过程的质量，必须做好药敏质控。
1、常用的药敏质控标准菌株
大肠埃希菌25922、金黄色葡萄球菌25923、铜绿假单胞菌27853用于常规纸片法药敏质控。
大肠埃希菌35218产β－内酰胺酶，肺炎克雷伯菌700603用于含β－内酰胺酶抑制物的复方制剂的质控和ESBLs的检测质控。

流感嗜血杆菌49247、49766和10211用于嗜血杆菌的药敏质控。

淋病奈瑟菌49226用于淋病奈瑟菌的药敏质控。

粪肠球菌29212和33186用于磺胺类和TMP的药敏质控。

金黄色葡萄球菌29213用于MIC测定的质控以替换25923。

肺炎链球菌49619用于肺炎链球菌的药敏质控。

幽门螺杆菌43504用于HP的MIC质控。

脆弱拟杆菌25285，多形拟杆菌29741，产气荚膜梭菌13124，迟缓真杆菌43055用于厌氧菌的药敏质控。

2、质控株的保存 尽管质控标准株比其他一些菌株药敏结果是相对稳定的，但反复多次的传代不可避免地会造成菌株的变异。为防止变异，必须将标准株冻干保存。每月从冻干株中复苏1次，种入大豆酪蛋白消化肉汤中（厌氧菌可用GAM肉汤等）作为工作株。工作株可存于4-8℃，并于每周转种1次。通常工作株转种4~5次后即须弃去。在质控中，如发现工作株结果有疑问，应予以更换。反复传代亦易使其敏感性变异，特别是铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，将会丢失对脲基青霉素的敏感性。如无冻干条件时，可于肉汤中加入15%的甘油和脱纤维羊（或兔）血，或使用含50%小牛血清的肉汤，然后接种标准株，存于-20℃以下环境中，亦可防止变异。

3、药敏质控方法 质控株应每天随临床分离株一道进行药敏试验 质控株的药敏结果如果在质控允许范围内（参见最新NCCLS文件），说明实验条件符合要求，结果可信；若药敏结果在质控允许范围外，则实验中可能存在差错。由于质控允许范围的最大值与最小值是质控株在标准条件下多次重复实验的95%可信限，故20次连续质控结果中仅允许1次落在范围外，但不能偏离质控允许范围中间值[（最大值+最小值）/2]4个标准差。由于允许范围恰好包括4个标准差，故落在允许范围外的抑菌圈直径一定要在离中间值一个允许范围（中间值±1个允许范围）之内。此外，20次或更多次药敏结果的平均值应接近中间值。如果20次连续质控结果中连续2次或不连续3次以上的结果超出了允许范围，则提示实验过程中存在问题，必须查找原因加以解决。
常规的药敏质控可按下法进行：连续测定某药对质控株的药敏结果，每天一次，共测30天，取得30个值。
⑴如果仅有三个以下的值超出允许范围，则结果基本可信，可改每天质控一次为每周一次。此后，若某周出现一次质控值超出允许范围，则须连续质控五天，每天一次：①若五次结果皆在允许范围以内，则继续每周一次的质控；②五次结果只要有一次失控，则改每周一次质控为每天一次，直至完成30天，其间失控次数若在三次以内，则再改为每周一次。
⑵如果有四个以上的值超过允许范围，则继续做每天一次的质控。
⑶每当改变试剂、药敏纸片和培养基等时，均要重新进行连续30天的质控。
⑷每次失控均要查找原因，纠正后才能发出报告。

二、培养基、试剂和染色的质控
1、 培养基的质控 包括以下四个方面：① 无菌试验，每批培养基在高压或过滤除菌后均要抽取样本进行培养，以证实无菌生长。② 支持生长试验 以适宜的菌株接种，经培养应生长良好。③选择和抑制生长试验，对选择性培养基应至少分别选1株可生长、1株被抑制菌进行接种培养，可生长菌应生长良好，被抑制菌应不能生长。④ 生化反应培养基至少应分别选阳性和阴性反应菌株各1株，以证实应有的生化反应。常用的质控菌见表2，请正确选用。

2、生化反应试纸和试剂的质控 试纸和试剂无论是外购的还是自制的，在使用时一定要注明开启时间和失效期。测定代谢产物的试纸或试剂，要用已知阳性和阴性的菌株进行测试，并作好测试记录。测定代谢产物的试剂，要防止细菌的污染。触酶、氧化酶、凝固酶试剂在开瓶时以及使用中，每天至少要分别用一阳性和阴性菌测试1次。
杆菌肽、Optochin、ONPG、XV纸片（条）在开瓶时以及使用中，每周至少要分别用一阳性和阴性菌测试1次（XV纸片仅做阳性菌）。用于分枝杆菌鉴定的试剂在开瓶或配制时，以及每次使用时，均要做阳性菌对照（铁的摄取试验还要做阴性对照）。
抗血清在开瓶时和使用中每月需分别用阳性反应和阴性反应菌做1次测试。抗原检测试剂和DNA探针在每次操作时，均要设阴、阳性对照。
其他试剂和纸片仅在开瓶或配制时，做1次阴、阳性反应测试即可。

3、染色的质控 质控结果应作好记录。

三、仪器设备质量监测
实验室内的各种仪器设备的运行情况，应每天进行监测，每一仪器均要有专人维护保养，仪器上要贴有运行记录卡，每天由维护保养人记录温度等指标的变化情况。一旦发现问题，立即进行维修。
卫生部临床检验中心关于临床微生物实验室室内质控要求

药物敏感试验的精确度与准确度受多种因素的影响，如细菌的接种量，试验稳定性，培养基的质量和操作员的熟练程度等。培养基批号改变或质量差，及抗菌药物纸片在实验室操作和贮存过程中活性下降或失效是常见的影响因素

1. 药敏试验质控

按美国NCCLS规定，(1)质控菌株应按标准方法与临床标本种分离菌同步进行药敏试验。(2)更换药物或培养基时必须用相应质控菌株测试；(3)所有质控菌株在实行常规监控（一周一次质控）前应连续监测30天。对每种药、每种菌，30次试验种失控结果不能超过3个。如果30天监控结果完全符合上述要求，可转为一周一次质控的方法。只要抑菌环直径超出可接收范围都必须校正。当失控原因不明时，可用相应质控菌株连续监测5天；每种菌对质控中每种抗菌药物同时测试5个抑菌环，如果结果全部达到可接收范围，可恢复一周一次质控。

2. 其它室内质控试验

卫生部临床检验中心细菌室参考美国CLIA88及NCCLS规定，并根据国情制定了药敏试验质量控制要求，三级医院类和二级医院类要求有所不同，规定如下：

（1）每个工作日必做质控（阴性对照及阳性对照）：过氧化氢酶，凝固酶，氧化酶，ß-内酰胺酶。

（2）每周必做质控：各类染色。

（3）需用时，带阳性对照做的项目：杆菌肽，ONPG，X、V因子（二级医院类不要求）。

（4）药敏试验质控：三级医院类跟药敏试验每日做，二级医院类每周做一次。

3. 质控菌株的保存

（1） 使用中的质控菌应贮存在胰大豆琼脂（非苛养菌）或营养丰富的巧克力琼脂斜面（苛养菌），4-8℃保存，每周传代一次。

（2） 长期贮存，可用5%小牛血清肉汤，10%胰大豆肉汤，10%-15%甘油，脱纤维羊血或脱脂牛奶，于-20℃甚至更低温度保存。应以不明显改变菌株原有的抗菌谱为标准。

（3） 每次使用前应把菌株传代到相应的平皿上或使其获得单个菌落。

4. 抗菌药物纸片的保存

密封包装置于-20℃以下低温或超低温保存。常规使用纸片可从低温取出一周用量。

5

. 接种菌液浓度准备（需氧菌或兼性厌氧菌）

纸片扩散法：过夜培养的质控菌用生理盐水配制成0.5麦氏单位，菌量约1×108 cfu/mL。

稀释法：将菌液配制成108用多头接种器或加样器在每一浓度梯度的肉汤或琼脂中加入菌悬液，使最终浓度达到：肉汤稀释法为105 /mL，琼脂稀释法为104 /点。

6. 贴抗菌药物纸片：每两个纸片中心距离不少于24mm，纸片一旦贴在某一位置上，不应变动位置。贴完纸片的平皿15分钟后再置35℃孵箱培养16-24小时。

7. 读数：用游标卡尺量取抑菌环直径，以没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈边缘，极其细小菌落生长可以忽略不计。变形杆菌迁徙生长使抑菌环内生长的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶和磺胺异恶唑引起的细微生长，生长层小于20%可忽略不计。