浅谈生物类似药中表达载体构建和稳定细胞株----8号资料。。。

个人浅见，抛砖引玉，请各位站友踊跃讨论。。。

给刚进入这个行业的脑补一下吧，主要是从申报资料所需要写哪些试验的角度出发，各个部分的技术请高手站友补充本帖。

用一个比较完整的目录吧，在中间穿插讲述！

研究概述 

一 、宿主细胞的选择 

1）宿主细胞来源和历史

         （如果是类似药，请将原研药的宿主细胞搞清楚，文献支持一下。另外，什么购买合同什么的现场核查会查的。） 

2） 宿主细胞一般特性 

二、 重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定 

1 、目的基因来源 

         （在此特别提醒，千万不要专利和Drugbank中的序列奉为圣经，一定要购买原研药，质谱测序确定氨基酸序列，目的基因可以反推。不管是类似药还是新药。）

2 、轻、重链表达载体的具体构建

         （据我了解，主要有GS系统和dhrf系统，所用的表达载体都必须有清楚的来源，背景明确。表达载体的图谱、相关的测序结果、电泳图等等）

3、 载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选 

1 ）转染及稳定多克隆细胞株筛选 

2 ）重组单克隆工程细胞株的筛选 

       （筛选方法估计都是有限稀释法吧，应该在两轮每孔0.5个cell，基本上是得到单克隆的，但是这里大家越来越重视单克隆证据了，这部分内容生物制药版块有几篇帖子说了很多，不在赘述。）

       （筛选过程不要光看到表达量，抗体的质量也是很重要的，尤其是类似药，你在此筛选的细胞株表达的抗体跟原研药的质量越相似越好，后期工艺的难度就更小。当然这也是一个平衡，case by case。）

4 、重组工程细胞的初步鉴定 

        （具体可以考察生长特性、目的基因、表达量、抗体质量等等）

三、 重组工程细胞库的建立 

1、 细胞库的建立

1）研究细胞库（RCB）建立 

2） MCB和WCB建立（在符合GMP条件下建立，批记录清楚。）  

2、 细胞库的管理

         （语言简单，但是我想说另一个问题，现场核查的时候，现场查核必查这个，还现场考核了我们的实验员是如何控制液氮含量的。管理细胞库的出入库记录、细胞出入库审批单，都要手写的，纯电子版的老师会不认可的，去药明康德核查实际发生过的。）

四、细胞库的检定 

4.1 细胞鉴定 

4.1.1 生长特性的鉴定 

4.1.2 RCB目的基因和表达框架分析（目的基因测序，与理论序列比对） 

4.1.3 MCB和WCB、EOPC目的基因和表达框架分析

        （目的基因测序，与理论序列比对。有个疑问，我觉得是不是应该分析一下mRNA，从转录后的水平考察一下，求助站友？）  

4.2 微生物污染检测 

1） RCB的无菌检测、支原体检测、病毒检测（我们还自检了几种病毒，包括猪细小病毒、牛病毒、逆转录病毒，具体没什么检测这几项，我也不知啊！） 

2） MCB的无菌检测、支原体检测、小鼠细小病毒检测 

3） WCB的无菌检测、支原体检测、小鼠细小病毒检测

4） MCB和WCB中检院检测（按最新版CH.P）

         （除了中检院，现在武汉大学也可以做，站友知道还有其他机构吗？） 

5） 细胞库检定小结 

6） 中试生产终末细胞（EOPC）检测（具体检测哪些就不细说了，可以问问委托中检院的老师。） 

7） 中试生产终末细胞收获液中检院检测（具体检测哪些就不细说了，可以问问委托中检院的老师。） 

五、细胞株的稳定性研究 

1、RCB、MCB和WCB传代稳定性实验

         （10w或12w，不同公司做法不一，连续传代，每两周的细胞进行批次补料培养表达试验，这里有三个问题需要站友解答一下，1>连续传代时间由什么依据而定？2>批次补料培养表达试验是用摇瓶还是用反应器，反应器的规模？3>是把每隔两周传代的细胞先冻存起来，然后一起复苏表达，还是分开做表达，每隔两周就进行批次补料培养表达，那种更合适？有法规支撑吗？）

         （除了进行了细胞株传代目的产物表达水平的比较，我们是画了一个趋势图，比较直观。还将0周和周末一周的细胞的基因水平进行了测序，检测是否有突变） 

2 MCB、WCB和EOPC基因拷贝数的比较

         （计算每一个细胞的基因拷贝数，比较三者的基因拷贝数情况。） 

3 MCB/WCB保存稳定性试验

         （我们是定的计划是两年测一次，检测表达量，不知道这块大家有没有做的，需不需做，请站友讨论！）

4 细胞株的稳定性研究小结

         （确定一下限定代次。） 

六、总结 

七、生产用其他原材料 

         （这块我们当时把培养基、培养添加物、纯化的关键物料都列上了，不知道有没有站友明确的没？）

这部分我确实不怎么懂，只是搞注册的时候正好接触了这块资料，群里的高手不要隐身啊！不要隐身！不要隐身！重要的是说三遍！