U6 PCR的CT值过低，MIRNA溶解曲线峰低矮， 怎么回事？

各位高人，看了这么多贴都说自己U6做出来CT值高的，我的CT值做出来低啊，闸板？

做了两次了，每次多个多个样本，相同RNA量逆转录，PCR定量时相同模板量，最后U6的CT值都在 6-8左右，求高人解疑啊？万分感谢！

U6引物如下：

U6  F ：CTCGCTTCGGCAGCACA

U6  R： AACGCTTCACGAATTTGCGT

用U6 R：AACGCTTCACGAATTTGCGT作为逆转录引物，引物终浓度500nM和60nM都用过

RNA用TRIZOL提取，逆转录20ul体系加入2ugRNA。

逆转体系如下：20ul体系

逆转体系一：

dNTP（10mM）                        1ul

MMLV(200U/ul)                      0.8ul

RNA酶抑制剂（20×）               1ul

逆转录buffer（5×）                  4ul

U6逆转引物（10uM）               1ul

MIRNA茎环逆转引物（10uM）1ul

RNA模板                                   2ul（共2ug）

DEPC补足20ul

逆转体系二：

dNTP（10mM）                     0.75ul

MMLV(200U/ul)                      0.2ul

RNA酶抑制剂（20×）               1ul

逆转录buffer（5×）                  4ul

U6逆转引物（1uM）                1.2ul

MIRNA茎环逆转引物（1uM） 1.2ul

RNA模板                                   2ul（共2ug）

DEPC补足20ul

逆转录条件如下：

一：42℃ 60min ，70℃ 10min ，4℃∞

二：25℃ 30min，42℃ 30min， 85℃5min， 4℃∞

逆转出来的模板按如下体系（10ul）PCR扩增

PCR MIX                         5ul

上下游引物（10uM） 各0.2ul

cDNA                               1ul

ddH2O                             3.6ul

U6的溶解曲线很好

黄色(CT=7)和紫色(CT=20)扩增曲线是第二种逆转录体系分别在第一种和第二种逆转录条件下产物的PCR扩增曲线，明显看到延长了逆转录时间后产生的模板进行PCR扩增时CT值明显降低（CT=7）.

绿色和棕黄色曲线是第一种逆转录体系在两种逆转条件下的逆转产物PCR的扩增曲线，CT=7，但扩增产物荧光强度明显低于第二种体系。

接下来是miRNA

第一种逆转录体系在两种逆转条件下的产物的PCR扩增曲线及溶解曲线如下，溶解曲线没法看，明显的有非特异扩增，而且溶解峰低矮，产物溶解曲线拐点不明显。

这是第二种逆转体系的在第二种逆转录条件下产物的PCR扩增曲线和溶解曲线，溶解峰虽然仍然低矮，但产物至少单一，但是溶解曲线仍然拐点不明显。

以上是我的试验结果求高手解答

U6低CT值是否是体系内模板量的真是体现，及逆转录模板本身就拷贝数很高。

miRNA溶解峰低矮，且曲线无明显拐点，是引物本身问题 还是什么？