膜片钳脑片制备

关于脑片活性及细胞状态

从鼠到脑片共涉及几个环节，每个环节都有若干小细节需注意，任何一个环节出问题，都可能影响结果。一般，P14左右的 Ｃ57，脑片基本全部是活细胞，形态好，才能认为没问题。细胞好不好，镜下基本可判定，外形饱满无皱缩，胞壁折光度好，胞膜无皱褶缺损，胞核基本不可见，外形看起来有生物的、自然的美感，如同看人体，嘿嘿。个人体会，有例外，如果孵育液偏酸，比如自行用盐酸调PH值至7.4后再通混合气（这件蠢事**过），或者混合气通气速度太快，这会导致细胞仅仅看起来不错，但是，你懂的。

1小鼠：是否活跃健康，是否饥饿状态，多大年龄，断头前是否惊恐应激；若有必要，断头前可行乙醚麻醉；

2试剂：所用试剂种类正确（推荐sigma）；注意水合物等引起分子量变化的因素；

3 CO2/O2：比例是否正确，5%:95%；实际混合比例有没可能与标示不一致；混合气是否久置或压力太低，注意CO2比O2密度大，久置可能分层CO2沉于瓶底；

4液体配置：最好当天配置，所用试剂剂量准确；配置过程中不能有沉淀，尤其警惕搅拌很久才消失的固形物，因为不能排除肉眼不可见微粒影响溶液离子浓度，配置时一般要求CaCl2最后加入减少沉淀概率；

5液体准备：

切片液：速冻成冰水混合物，要求最终仅含微量冰，因结冰越多，液体渗透压越高；

通CO2/O2混合气60min，充分氧饱和，CO2联合HCO3-可调节液体酸碱度；这儿时间很重要，一定要用养鱼的气泡石通气，有老师测过32-35度液体用气泡石30min可通气饱和，液体温度越低，所需时间应越长（个人观点，因为液体温度越低，大部分气体的溶解度越高）。有老师测过，通气60min后液体PH值7.6降为7.2。另外混合气流速也很重要，园子里黑曼老师在多年前讨论过这个事http://www.dxy.cn/bbs/thread/7266284，当流速慢时PH有可能大于7.5 ，流速太快时PH有时会小于6.8。PH太高太低对细胞都不利。我自己体会：PH太低会导致细胞看起来不错，实际却无法持续封接记录。

切片槽中亦应通CO2/O2混合气；

孵育液：加温至36度左右（有认为32-35度更好），注意是温度计实测溶液温度，而非水浴槽设置温度；

通CO2/O2混合气60min(时间！！，理由同上)；

孵育篮要稳定，避免脑片翻滚；个人认为孵育时脑片离液面2cm左右为宜，太浅易受液面波动影响，太深静水压太大（?）

6切片机：我室用Laica VT 1000s切片机，设置speed=3(有人认为2更好)，振幅=8 ；注意切片槽加冰预冷，底托以胶粘脑片，现用百得502胶效果不错；另外，注意刀刃，尤其是为节约成本而反复使用的刀刃，其质量好坏可直接影响细胞质量；

7断头取脑：速度！最好30sec内取脑入冰水混合物中(现在还做不到，偶尔可以)，注意取脑过程中避免挤压脑组织；

8孵育：孵育篮底注意不能有气泡，液体加热及通气后必然产生气泡，置入脑片时一定要检查吹除；孵育30min后转入记录槽，记录槽内如果未行温控，需注意室温的影响。个人认为室温20-25度可能最合适，室温太低细胞质量肯定差，尤其冬天，要全天开空调，早早开空调，不仅要室温升起来，台面及机器的温度也要全升起来，否则你想不到哪儿会坑你一下。

最后补充几句：1各种不同版本的切片注意事项细节不同，强调的东东也不同，甚至有常温切片的文献，能切出好片子的方法就是好方法，不求同。

2细胞状态真的很重要！！如果细胞状态不好，要找到问题出在哪儿，这才是本事。从头到尾捋一遍，把绝对没问题的环节排除，剩下的逐项改进。绝对没问题?      敢这么自信，得死多少老鼠啊? 神枪手是**喂出来的，没办法。

3adult rat：20ml注射器抽取ACSF预冷备用。麻醉 ：200g，3%戊巴比妥钠0.7-0.8ml。开胸，左室扎入，弯钳固定，剪开右心耳放血。注射毕，断头，取脑，0度ACSF中浸泡1min。切，略。