【求助】关于ic50（在园中没有搜到答案的问题）

我是个初学者，现在实验中出现了一些问题，希望大家指教。
我的实验是筛选抗癌药物（阿霉素）对肿瘤（肝癌SMMC）细胞的药物敏感浓度，按所查资料决定用MTT法监测阿霉素对肝癌的ic50。我的实验是这样设计的。

取96孔培养板，每孔加细胞悬液200uL，24小时细胞贴壁后，吸出培养液，实验组加不同药物工作液（用RPMI1640培养液溶解的阿霉素，浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ug/ml 8个浓度梯度）150uL，对照组加培养液150uL，每个药物浓度重复5个孔，置37℃，饱和湿度、5％CO2孵箱培养24、48h。每孔加20 uL（MTT）反应4h，吸去液体，每孔加二甲亚砜150 uL，室温下放置15min，在波长为490nm用酶标仪测定每孔的吸光度值。

出现的问题是：
1.计算结果IR都达不到50％。我们分析原因可能是，（1）细胞接种时状态不好或者消化时间过长，导致细胞接种后生长缓慢，使实验结果实际是杀伤率而不是抑制率。（2）药物浓度过低，没有达到ic50。
于是调整细胞状态并加大药物剂量重复前述实验（药物浓度最大60ug/ml),结果就出现了下面的问题。
2.加药后观察96孔板，发现在15、30、60ug/ml等几个浓度的板中有药物的结晶，用酶标仪测量后发现这几个浓度的吸光值基本相同，已知阿霉素在483.5nm处有吸收峰。请问，是否是结晶药物影响了吸光值，使吸光值偏大，因而使IR仍未达到50％（在41％以下），而且几个较高浓度的IR基本相同（用显微镜观察细胞形态，发现细胞凋亡随浓度梯度改变还是很明显的）。
我又用针孔滤器将阿霉素过滤重复前述实验，发现结果IR还是没有达到50％，但根据我所查到的资料，SMMC细胞对阿霉素还是很敏感的，ic50一般在0.5－8ug/ml之间，（而阿霉素易溶于水，且水溶液稳定）。我想问，
3.出现这样的实验结果是否是我用的肿瘤细胞对阿霉素有了抗药性？我是否应该更换细胞？
4.我向一些人请教，他们说，测ic50不必使IR达到50％，但所查资料都有高于50％的值，而且我在园中搜的结果都说应该有高浓度的，这样计算的结果才能准确。究竟需不需要高浓度的？
5.测ic50时，药物和细胞作用的时间有没有严格的限制，24h、48h、72h有没有分别？ic50会不会随着时间延长而增高或者降低？我应该选择多长时间比较合适？
6.我的实验还有哪些存在的问题，而我自己还没有产生疑问？

关于MTT和ic50,我在园中搜过了很多次，都没有搜到，或者搜到可能有关的题目但因为积分不够都没有看到。希望大家抽出一点时间不吝赐教，感激不尽！