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【求助】BrdU标记的细胞增殖实验

最后编辑于 2022-10-09 · IP 广西广西
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这个帖子发布于 11 年零 0 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做BrdU标注的细胞增殖实验,用流式细胞仪来检测。实验做了好多次,除了有两三次预实验成功之外,大部分的预实验都失败了。现将所用试剂和实验操作步骤列出,望高手指教
实验处理:取小鼠的脾脏细胞,制备单细胞悬液,细胞计数,在96孔板钟种6个孔,每孔30万细胞,每孔加入CD3和CD28刺激,使二者终浓度为7.5ug/ml,每孔加入BrdU,使其终浓度为10uM。培养3天后收集细胞。
一、所用试剂
1、BrdU粉末 购自Invitrogen 货号:B23151
2、BrdU抗体 购自Invitrogen 货号:B35140
3、固定、渗透用的试剂 (有两个公司的,都试过了)
1)、BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit 货号:554714
PermeabilizationBuffer Plus 货号:561651
2)、ebioscience
Foxp3 Staining Buffer 货号:00-5523-00 这是做胞内因子检测的流式试剂盒。
4、DNAse I 购自sigma 粉末,货号:D4513
5、DPBS(缓冲液,含钙镁) 购自Invitrogen 货号 14040-117
二、实验步骤
以10的6次方细胞为例
1)、表面抗体孵育,30min,用1ml的PBS清洗细胞,离心5min,200-300g,弃上清。
2)、用100ul的Cytofix/Cytoperm重悬每一管细胞。孵育15-30min.用1X的BD Perm/Wash 缓冲液洗细胞,离心 5min,200-300g,弃上清。
3)、每一管加入BD CytopermPermeabilization Buffer Plus 100 ul 孵育细胞,冰上10min,加入1ml 的BD Perm/Wash洗 细胞,离心5min,200-300g,弃上清。
4)、用100ul BDCytofix/Cytoperm Buffer重悬每一管细胞,在冰上孵育5min。用1 ml BD Perm/Wash Buffer来清洗细 胞。离心5min,200-300g,弃上清。加入DBPS(含钙镁)重悬细胞,离心5min,200-300g,弃上清。
5)、用DNase I处理细胞,每管细胞用酶量为30ugDNase酶液加入之后漩涡振荡2s,37℃水浴孵育1h。
6)、用BD Perm/Wash Buffer来稀释抗体或者稀释其他染细胞内因子的抗体,振荡2s。在室温之下孵育抗体20min。
7)、上样检测
三、实验结果
如图,左边是没有进行染色的图,右边是进行染色的图
img

我猜想实验失败的原因有如下几点:
1)用来做实验的BrdU溶液失效。我用来做实验BrdU用PBS溶解,用0.45um的滤器过滤。BrdU是光敏性(我今天才知道),当时在配置过程中我没注意避光。配置的浓度为2mg/ml。另外我存储的期间也没注意避光,只是放在4度冰箱里(冰箱关上门,冰箱里的灯会关上)。到今天,原先配置的BrdU溶液已经有二十多天了,就在冰箱里放着。这样操作,是否会导致BrdU溶液失效。
2)用DNAse I暴露BrdU抗原这一步失败。酶虽然用的是BD推荐的酶,但是我不知道我用来溶解酶的溶液能否让酶发挥活性。
实验做了两个月,基本没有进展。请高手点拨


























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