【主题学习】流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞

流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞：
主要试剂：1染色缓冲液：PBS+1%FBS+0.1%NaN₃
2EBioscience Fixation/Permeabilization(cat.00-5523):临用前将固定液/穿膜剂浓缩液用稀释液按1:3比例稀释，配制后的液体不能存放超过1小时。
3抗Foxp3抗体及同型对照：用同型对照抗体来界定Foxp3的阴性置信区，从而确定样本Foxp3阳性信号。
4抗CD25抗体及其同型对照：由于CD25是诱导性表达分子，且表达量不均一，或多或少，荧光信号有强有弱，一般在流式分析分析图上呈连续散点，无明显的CD4+CD25+细胞界定，为精确起见，故要用其同型对照抗体来确定其阳性信号。
5抗CD4抗体：由于CD4是组成性表达，表达量均一，荧光信号强，一般在流式图上非常容易区分CD4+细胞，故不必利用同型对照抗体确定其阳性信号。
操作方法：
1常规分离外周血单个核细胞或脾细胞，调整调整细胞浓度至2×10⁷个/ml。
2取五只流式管，分别标记空白、CD5同型对照、CD4CD25、Foxp3同型对照、CD4CD25Foxp3，于各管中分别加入100ul细胞悬液。
3表面标记：于各管中分别加入CD4、CD25抗体及同型对照，空白管不加任何抗体；CD25同型对照管加CD4抗体和CD25同型对照抗体；CD4CD25管加CD4抗体和CD25抗体，Foxp3同型对照管加CD4抗体和CD25抗体，CD4CD25Foxp3加CD4抗体和CD25抗体，混匀，4℃避光孵育30min。
4 加染色缓冲液2ml，1500rpm×5min离心洗涤2次，弃上清液。
5边涡旋边加冷固定/穿膜剂1ml（也可适当减量），4℃避光孵育30min-18h。
6加穿膜缓冲液2ml，1200rpm×5min离心洗涤2次，弃上清液。
7空白、CD25同型对照、CD4CD25管用300-400ul染色缓冲液悬浮，混匀，避光待测。
8于Foxp3同型对照、CD4CD25Foxp3管中分别加入Foxp3同型对照抗体或抗体（用穿膜缓冲液稀释），4℃避光孵育至少30min。
9用穿膜剂缓冲液2ml，1200rpm×5min、离心洗涤2次，弃上清液；悬浮于300-400ul染色缓冲液，上流式细胞仪检测。
结果分析：
先上空白管，调节电压，并以CD25同型对照调节补偿，确定CD4+CD25+细胞群，再以CD4+CD25+细胞设门，以Foxp3同型对照确定其阳性信号，最后测定CD4CD25Foxp3管，检测CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4阳性细胞中的百分比或占CD4+CD25+细胞中的百分率。