【求助】关于DCFH-DA探针检测细胞内ROS实验，急求帮助，非常感谢！

新人求助，本人最近在做细胞内活性氧ROS检测实验，细胞为HEK-293细胞，采用96孔板，实验分组为control对照组（只加细胞）、损伤组（加细胞，然后用双氧水损伤）、实验组（加细胞，后加样品处理，最后加双氧水损伤）。实验结束时吸弃培养液，加入浓度为10uM的DCFH-DA荧光探针溶液，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。最后用多功能酶标仪检测荧光强度，或用激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度。现主要有以下三个问题，求教有此实验经验的同学和老师，希望能和大家交流下，第一次在丁香园发帖，丁当不多，非常感谢！
1、做柱状图时，纵坐标为荧光或相对荧光强度。荧光强度是以对照组的荧光强度为基准来计算吗？看了好多文献，数值范围差的很多。想请教您是如何计算这个数值的？
2、按照说明书，最后一步用无血清细胞培养液洗涤细胞三次去除残余荧光探针后，是直接上酶标仪测或者上激光共聚焦显微镜观察。孔板里面一点培养液都不要的话，这样细胞不受影响吗？
3、由于HEK-293细胞贴壁能力一般，虽然操作很温柔，但在最后润洗中还是会不可避免的吸掉一小部分细胞，尤其经过损伤的细胞，死细胞都被润洗掉了，这样会导致control组比损伤组的ROS含量还要高，这不符合实验预期结果呀！而且在激光共聚焦显微镜下观察，会发现细胞数量很少！请问大家是怎样处理的呢？有什么固定细胞的方法吗？


背景：本人购买的是sigma公司的DCFH-DA荧光探针粉末（2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate），DMSO配成10mM储备液，-20℃保存，实验时稀释1000倍至浓度为10uM使用。DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)是非标记性的氧化敏感的荧光探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光以判定细胞内活性氧的水平。