肌氨酸氧化酶法测定血清肌酐

关键词：国家一级标准物质 食品微生物快速检测 环保标准物质 岩石标准物质
【实验原理】
肌酐在肌酐酰胺水解酶的催化下生成肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下水解成肌氨酸和尿素，肌氨酸再经肌氨酸氧化酶催化生成甘氨酸、甲醛、过氧化氢。过氧化氢、2，4，6-三碘-3-羟基苯甲酸及4．氨基安替比林在过氧化物酶催化下反应生成紫红色化合物。
【试剂与器材】
1．肌酐校准液。
2．试剂主要成分
试剂I
N-三羟甲基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液(pH 8．1) 30mmol／L
肌酸酶(微生物) ≥333μKat／L
肌氨酸氧化酶(微生物) ≥133μKat／L
抗坏血酸氧化酶(微生物) ≥33μKat／L
2，4，6-三碘-3-羟基苯甲酸 5．9mmol／L
试剂Ⅱ
N-三羟甲基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液(pH 8．0) 50mmol／L
肌酐酰胺水解酶(微生物) ≥500μKat／L
过氧化物酶(辣根) ≥1 6．7μKat／L
4-氨基安替比林 2mmol/L
亚铁氰化钾 163μmol／L
【操作步骤】
1．自动生化分析法按仪器说明书的要求进行测定。
2．手工操作法
【结果计算】
肌酐（μmol／L）={[A测定2﹣A测定1×K]﹣[A空白2﹣A空白1×K]}/{[ A标准2﹣A标准1×K]﹣[A空白2﹣A空白1×K]}×校准物浓度
K=（标本体积﹢试剂Ⅰ体积）/反应液总体积=2050μl.3050μl=0.672
【参考区间】
健康成年男性：59～104μmol/L；健康成年女性：45～841μmol／L。
【注意事项】
1．胆红素与溶血的干扰不可忽略，应选用新鲜无溶血血清，标本于4℃保存可稳定7天。
2．如试剂混浊，或在546nm波长下以蒸馏水为空白，试剂吸光度大于0．2时，请勿使用。
【评价与思考】
1．酶法测肌酐通常采用肌酐酰胺水解酶(肌酐酶)法和肌酐亚氨水解酶法。肌酐酰胺水解酶法利用肌酐酰胺水解酶催化肌酐生成肌酸，检测肌酸在肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶偶联作用下反应体系中NADH在340nm波长下的吸光度变化值反映出肌酐浓度高
低，方法特异性高，适用于手工及自动生化分析仪测定。亦可采用肌酐酰胺水解酶．肌酸酶一肌氨酸氧化酶一过氧化物酶偶联法，利用Trinder反应产生的醌亚胺类物质颜色深浅反映出肌酐浓度高低。肌酐亚氨水解酶法利用肌酐亚氨水解酶水解肌酐生成N．甲基乙内酰和氨，再用电极法测氨，准确性好，特异性高，但易受内源性氨干扰。
2．酶法测定肌酐是解决肌酐测定中非特异性干扰的根本途径。本试验采用双试剂法，在第一试剂中加入了肌酸酶，设置两步反应，能有效地去除内源性肌酸对测定的干扰。
3．Trinder反应受胆红素和抗坏血酸的干扰，可在试剂中加入亚铁氰化钾(或者亚硝基铁氰化钾)和抗坏血酸氧化酶消除之。
4．本方法在肌酐含量为0～4420μmol／L(0～50mg／d1)范围内线性良好，批内CV值0．9％～1．81％，批间CV值2．21％～2．85%；回收率：99．8％～102．9%。
5．肝素、枸橼酸钠、氟化钠、EDTA等在常规用量下对本法无干扰。