【进展】02122014-Nature-Article-δ-类阿片受体信号传导

02122014-Nature-Article-δ-opioid-receptor
Title: Molecular control of δ-opioidreceptor signaling
题目：δ-类阿片受体信号传导的分子控制
Abstract Opioids represent widely prescribed andabused medications, although their signal transduction mechanisms are not wellunderstood. Here we present the 1.8? high-resolution crystal structure of thehuman δ-opioid receptor (δ-OR), revealing the presence and fundamental role ofa sodium ion in mediating allosteric control of receptor functional selectivityand constitutive activity. The distinctive δ-OR sodium ion site architecture iscentrally located in a polar interaction network in the seven-transmembranebundle core, with the sodium ion stabilizing a reduced agonist affinity state,and thereby modulating signal transduction. Site-directed mutagenesis andfunctional studies reveal that changing the allosteric sodium site residue Asn131 to an alanine or a valine augments constitutive β-arrestin-mediatedsignaling. Asp95Ala, Asn310Ala and Asn314Ala mutations transform classicalδ-opioid antagonists such as naltrindole into potent β-arrestin-biasedagonists. The data establish the molecular basis for allosteric sodium ioncontrol in opioid signaling, revealing that sodium-coordinating residues act as‘efficacy switches’ at a prototypic G-protein-coupled receptor.
摘要 虽然阿片是被广泛使用也是被滥用的处方药，但阿片的信号传导作用机制并没有被彻底了解。在此我们展示1.8? 高分辨率人的δ-阿片受体（δ-OR）的晶体结构，这一结构揭示了一个钠离子在调节受体的功能选择性和持续活性别构性控制方面的存在及基础性作用。特异性δ-OR钠离子位点结构处于七束跨膜束集核心中极性相互作用网络的中心，其中钠离子对于受体降低的激动剂亲和状态具有稳定作用，因此对信号传导具有调节作用。定点突变以及功能研究结果显示将别构性钠离子位点残基Asn131变换为一个丙氨酸或缬氨酸会增加持续性由β-arrestin介导的信号传导作用。Asp95Ala、Asn310Ala和Asn314Ala的突变会将经典δ-阿片拮抗剂如纳曲吲哚（naltrindole）转变为可能对β-arrestin具有偏好性的激动剂。数据为阿片信号传导作用中别构性钠离子的控制作用建立了分子基础，揭示出钠离子的配位性残基在原型G蛋白偶联受体上以“有效性开关”的形式起作用。
（正文）
三种经典的阿片受体（?，κ和δ-OR）以及相关的痛敏肽（nociceptin）/孤啡肽FQ 受体（NOP）是对伤害感受（nociception）、情绪以及认知活动进行调节所必需的G蛋白偶联受体。这些阿片类GPCRs会通过内源性多肽（内啡肽-endorphins，脑啡肽-enkephalins，强啡肽-dynorphins，痛敏肽-nociceptin/孤啡肽FQ-orphaninFQ）、天然生物碱（鸦片）以及大量小分子激动剂与位于7跨膜集束胞外部分的正构性位点之间的相互作用而被激活。虽然人们已经对理解GPCR激活作用方面取得了一些进展，但对于负责包括信号传导、别构调控、功能选择以及活性持续方面的分子机制和结构特征还处于不清楚的状态。
1.8? 分辨率的δ-OR结构内容
在1973年进行的对于阿片受体的先导性研究工作发现钠离子的生理性浓度会改变阿片配体结合作用和信号传导，但并不知道是什么作用机制。为了弄清楚钠离子对阿片受体功能惊人的别构效应的分子机制，我们对N端带有融合蛋白b562RIL（BRIL）的人δ-OR（残基36-338）进行了结晶，并将其与选择性亚型配体纳曲吲哚（naltrindole）形成的复合物的晶体结构在1.8? 分辨率的条件下进行了解析（图1，扩展数据表1）。重要的是，高分辨率BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚的结构含有野生型蛋白序列，包括完整的胞内环状结构3（ICL3），这为我们研究一种非常类似接近于天然构象状态的阿片受体提供了机会。

Figure 1 |Interactions in the7TMcore of BRIL–dOR(DN/DC)–naltrindole.
a,BRIL–dOR(DN/DC)–naltrindole structure(light green, BRIL fusionomitted) and residues around the allostericsodium site (green sticks). Sodiumis shown as a blue sphere; red and pinkspheres are waters in the first and secondcoordination shells, respectively.Naltrindole is shown as orange sticks.
b,Hydrogen bonds (grey dotted lines) and hydrophobic residues (orangesurface,located below the allosteric site).
c,‘Sliced’ surface representation ofBRIL–dOR(DN/DC)–naltrindole showing the continuouspathwayconnectivitybetween orthosteric and allosteric sites.
d, 2mFo – DFc electrondensity map (grey mesh) contoured at 2s around residues, waters andsodiuminthe allosteric site. Hydrogen bonds are shown as black (first sodium ioncoordinationshell) and yellow (other hydrogen bonds) dotted lines. Arrowsindicateincreased b-arrestinconstitutive activity of ‘efficacy switch’ mutantsAsn1313.35Alaand Asn1313.35Val (yellow) and b-arrestin-biasedactivation inresponseto naltrindole in the Asp952.50Ala mutant (red).
图1 处于七跨膜核心区域的BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚中的相互作用
a，BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚的结构（浅绿色，BRIL融合蛋白部分略去）以及别构性钠离子位点（绿色棒）附近的残基。钠离子以蓝色球显示；红色球和粉色球是分别处于第一和第二配位层的水分子。纳曲吲哚显示为桔黄色棒。
b，氢键（灰色虚线）和疏水性残基（位于别构位点之下的桔色表面）。
c，对BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚结构横切面显示在正构位点和别构位点之间持续的途径连接性。
d，在别构位点附近的残基、水分子和钠离子的2σ 等高2mFo-DFc电子密度图谱。氢键以黑色（第一个钠离子配位层）和黄色（其它氢键）虚线表示。箭头标示对纳曲吲哚中Asp95^2.50Ala突变（红色）作出回应的“有效性开关”突变Asn131^3.35Ala和 Asn131^3.35Val 突变（黄色）的β-arrestin 持续活性的增加以及对β-arrestin偏好性激活作用。
人δ-OR1.8? 分辨率的结构与小鼠的在ICL3位点与T4溶菌酶融合的3.4? 分辨率的δ-OR（整体Cα原子的标准误为0.91?）很相似，而对于受体活性重要区域的原子细节的不同也随着结构的解析揭示出来。这些特征包括：（1）对处于“关闭”非活性状态ICL3构象的完全解析（图2）；（2）带有由水介导配体受体相互作用的正构位点详细的分子特征（扩展数据图1）；（3）人δ-OR分子上第三个胞外环状结构域（ECL3）的特殊构象（扩展数据图2）以及重要的（4）在七跨膜核心区域中别构性钠离子位点、水分子以及大量氢键相互作用网络的高分辨率特征（图1，扩展数据图3，4）。
所有的ICL3残基都在BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚结构中得到了很好的解析。Arg257^6.31（上角标表示使用Ballesteros-Weinstein 命名法的残基标记数）侧链的胍基基团似乎通过与主链上Leu240^5.67，Arg244^ICL3和VAL243^ICL3上的羰基之间形成一个扩张的氢键网络以及与Asp253^6.27上的羧基之间形成盐桥从而对ICL3的稳定具有重要作用（图2a）。Leu246^ICL3和Val243^ICL3的侧链插回到螺旋集束中并与Val150^3.54、Leu240^5.67和Leu256^6.30之间形成疏水性簇（图2b）。这一环状结构域还通过主链上Leu246^ICL3和Val150^3.54的羰基基团之间水分子介导的氢键网络与螺旋III之间具有相互作用，还与Arg239^5.66的侧链之间具有相互作用（图2d）。这些原子性细节说明在非活性的δ-OR中的ICL3处于稳定的“关闭”构象，这种构象会固定螺旋V和VI的细胞内末端。虽然这与热稳定的A_2A腺苷受体（A_2AAR；PDBID：3PWH）和视紫红质（PDBID：3CAP）中ICL3更“开放性”的构象相反（图2c），但在δ-OR中的ICL3与所见到的低分辨率NOP（PDBID：4EA3）的结构相似（图2b）。在所有四种阿片受体中的ICL3都具有高度的序列保守性，而这类阿片受体主要通过Gα_i/o-蛋白来传递信号，因此说明在所有亚型的阿片受体非活性状态中的ICL3可能会采用非常相似的“关闭”构象。ICL3的关闭构象可能对非活性态的阿片受体具有稳定的作用，从而对这类受体中起稳定作用的“离子锁”的缺乏起到补偿作用，在通常离子锁所需要的Glu^6.30侧链在这里换成了疏水性的Leu^6.30。
在正构位点口袋区域，BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚结构显示出与纳曲吲哚的吗啡喃基团之间由水分子介导相互作用的扩展网络，包括与螺旋V和ECL2中残基的相互作用（扩展数据图1a）。对于ECL3区域来说，有一个经典阿片受体与多肽结合作用关键选择性决定因素的存在，我们发现Arg291^ECL3的侧链限制了螺旋VI和VII之间特殊的环状结构域构象的形成，这一构象是通过与主链Val287^ECL3和Trp284^6.58上羰基基团形成的氢键网络形成的，而形成的环状结构为与纳曲吲哚形成π-π的相互作用而指向Trp284^6.58（扩展数据图2）。这种ECL3的构象与我们在低分辨率小鼠δ-OR结构中所见到的颇为不同，在人的δ-OR中有一个天冬酰胺侧链而不是Asp290^ECL3。这些有关人的δ-OR别构位点上结合口袋区域和配体结合作用的高分辨率细节为设计新的带有选择性和功能特征改善了的δ-OR配体和别构性调节剂提供了非常好的框架。

Figure2 | Structure of the humanδ-OR ICL3.
a,2mFo– DFcelectrondensitymap (grey mesh) of BRIL– δOR(ΔN/ΔC)–naltrindole ICL3contoured at 1σ. Polar and ionicinteractionsof Arg 257^6.31 are shownby orange dashed lines.
b,ICL3 loopcomparisonbetween BRIL–δOR(ΔN/ΔC)–naltrindole(green)andNOP (light grey) structures.Hydrophobic residues in the ICL3hydrophobiccluster are shown asorange spheres and oleic acid (OLA)moleculesare represented by yellowsticks.
c,ICL3 comparison of BRIL–δOR(ΔN/ΔC)–naltrindole(green)withA_2AAR (magenta; PDB 3PWH)and rhodopsin (RHO, grey; PDB3CAP).
d, Details of the hydrogenbondsbetween Arg 239^5.66,Leu 246^ICL3, Val 150^3.54and watermolecule(red sphere) are shown bygrey dashed lines.
图2 人δOR上ICL3的结构。
a，BRIL– δOR(ΔN/ΔC)–naltrindole的ICL3在1σ 的2mFo-DFc 电子密度图谱。Arg 257^6.31的极性和离子性相互作用由桔黄色虚线显示。
b，在BRIL– δOR(ΔN/ΔC)–naltrindole（绿色）和NOP（浅灰）之间的ICL3环状结构的比较。ICL3疏水簇中疏水性残基以桔黄色球表示，油酸（OLA）分子用黄色棒表示。
c，在BRIL– δOR(ΔN/ΔC)–naltrindole（绿色）和A_2AARP（紫色；PDBID：3PWH）和视紫红质（RHO，灰色；PDBID：3CAP）之间的ICL3环状结构的比较。
d，Arg 239^5.66、Leu 246^ICL3、Val 150^3.54 和水分子（红球）之间氢键的细节在图中以灰色虚线表示。
δ-OR中钠离子位点的独特特征
在别构位点上钠离子存在的证据与在高分辨率的A_2AAR（PDBID：4EIY）结构中所见到的类似，包括：（1）电子密度显示通过5个氧原子对于假定的钠离子位置的配位；（2）在离子与配位氧之间存在短距离（~2.4?）；以及（3）对于离子价位的计算（补充表1）。含有别构性钠离子的空穴是由16个残基的侧链形成的，其中的15个残基在A类GPCRs中高度保守（图1，扩展数据图3）。值得注意的是，BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚结构显示除了高度保守的Asp95^2.50和Ser135^3.39侧链以外，钠离子还直接由非保守性的Asn131^3.35侧链进行配位。虽然Asn131^3.35在阿片受体中是保守的（扩展数据图3b），但大多数（70%）A类GPCRs在这一位置上是一个疏水性残基，而高分辨率的A_2AAR结构中Leu87^3.35侧链指向脂膜。相反在BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)-纳曲吲哚结构中Asn131^3.35侧链指向钠离子口袋区域，将其氧（OD1）和氮（ND2）原子包在离子和正构性口袋之间（图1）。这些确切的原子位置在A_2AAR结构中由别构性钠离子位点的两个水分子所占据（扩展数据图3a）。除了Asn131^3.35侧链的OD1原子在钠离子配位中的重要作用外，ND2原子通过一个水分子与两个侧链OD1和Asp128^3.32主链上的羰基基团形成氢键（图1）；Asp128^3.32残基在正构位点上占据一个中心很深的位置并与纳曲吲哚的氮之间建立了盐桥。在钠离子、Asn131^3.35和Asp128^3.32之间的相互作用在受体的非活性状态下在正构区域和别构区域之间建立一个明显的连接轴。综上，δ-OR的别构性钠离子由5个氧原子进行配位，三个来自Asp95^2.50、Ser135^3.39、Asn131^3.35的侧链，两个来自结构保守性的水分子，它们组成了钠离子的第一个配位层（图1，扩展数据图3，4）。
别构位点钠离子的第二个配位层由三个残基的侧链形成（Trp274^6.48、Asn310^7.45、Asn314^7.49），还有另外两个水分子与第一个配位层之间形成接触（图1，扩展数据图3，4）。这些钠离子口袋的保守性残基属于两个最为人们熟知的A类功能性基序：螺旋VI中的CW^6.48xP和螺旋VII中的N^7.49PxxY（x表示可以为任意残基）（图1a），这些基序在GPCR激活进程中起重要作用。作为一个整体，含有钠离子和八个水分子的结构簇在受体分子被稳定在非活性状态构象中时，对受体核心的螺旋I、II、III、VI和VII之间大量的螺旋内氢键网络具有调节作用。相反，由激动剂结合的激活形式的A_2AAR结构显示由于螺旋的内移使钠离子的位点坍塌，说明在这种保守性钠离子口袋区域中的结构重排在A类GPCRs的激活中起重要作用。
δ-OR的功能特征
为了研究使用BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)所获得的结构性数据与野生型δ-OR之间的相关性，我们通过分别在HEK293细胞和Sf9细胞中表达野生型δ-OR和BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)，进行了受体与阿片激动剂和拮抗剂的放射性配体结合检验。我们发现BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)和野生型δ-OR显示出类似的配体结合亲和性（扩展数据表2），而且当二者表达在HEK293细胞中时，它们显示出对于Gαi介导的信号传导类似的功能性偶联作用（扩展数据图5a，b）。与经典的对于阿片进行的原位实验的结果相一致，NaCl的生理性浓度（140mM）会减少δ-OR多肽激动剂DADLE的亲和性，在野生型δ-OR表达的HEK293细胞和BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)表达的Sf9细胞中，这一激动剂与内源性多肽激动剂具有结构相关性，而NaCl的生理性浓度（140mM）则对拮抗剂结合的亲和性没有很大的影响（扩展数据表2）。为了证实钠离子位点的特异性，我们还检测了其他单价阳离子对于³H-DADLE饱和性结合中的影响。在所有几种检测的单价阳离子中，只有钠离子在生理条件下会减少³H-DADLE的结合作用（扩展数据图6）。
钠离子介导δ-OR的配体结合作用
虽然以前对许多A类GPCRs（如阿片受体、肾上腺素能受体、腺苷受体以及多巴胺受体）中钠离子对GPCR配体亲和性的别构性调节作用的现象有过描述，但这种别构效应的实质以及钠离子对于别构位点的亲和性都是未知的。为了对钠离子在其别构结合位点上的亲和性进行定量并弄清楚有关激动剂DADLE的明显负协调性的实质，我们进行了在不同NaCl浓度下的系列放射性结合检验并使用标准的别构模型对结果进行分析。我们的研究结果显示在野生型δ-OR表达的HEK293细胞中和BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)表达的Sf9细胞中钠离子具有基本相等的亲和性并产生出同样程度的负性协调性，虽然在BRIL-δ-OR(ΔN/ΔC)中DADLE的负性协调性有略微减少（图3a，扩展数据图5c，d，表1）。这些发现证实得到了结晶的构造物维持与野生型δ-OR在钠离子依赖性别构调节作用上基本相同的能力。还有，通过揭示钠离子对δ-OR的相对较高的亲和性（K_B=13.3mM），我们的研究证实了在生理性调件下（140mM）的钠离子位点处于饱和状态。
Asn131调节β-arrestin的偏好性
由于对别构性钠离子提供配位作用的残基与参与GPCR激活作用基序中的残基之间存在着密切的关系（比如NP^7.50xxY基序上的Asn314^7.49和Tyr318^7.53；图1），因此我们预测将选定的钠离子位点残基进行突变会对δ-OR的功能性发生调节。我们对某些选定的钠离子位点突变株系进行了功能研究（图3，4，表1，补充表2，扩展数据表3，图7）并发现将固定钠离子的δ-OR上残基Asn131^3.35突变为丙氨酸或缬氨酸在一定程度上会使β-arrestin突变的持续性活性提高（图3c，d，扩展数据图7）。值得注意的是，Asn131^3.35Ala或Asn131^3.35Val突变后β-arrestin的持续性活性超过了带有饱和浓度激动剂DADLE的野生型δ-OR可达到的激活水平（图3c），但Gα_i蛋白基础活性没有受到影响（扩展数据图7）。Asn131^3.35的突变株与野生型δ-OR相比会增加受体β-arrestin的持续性活性以及DADLE结合的亲和性，然而DADLE对于β-arrestin途径的有效性大大减少（补充表2，扩展数据表3）。重要的是虽然Asn131^3.35Ala突变破坏了“钠离子效应”，但即使与野生型受体相比其亲和性更低带有Asn131^3.35Val突变的受体仍会保持钠离子的结合作用（表1）。
在Asn131^3.35的两个突变之间钠离子结合作用亲和性的重要差异为我们进一步弄清楚钠离子在经典Gα_i-蛋白介导的信号传导中的作用提供了一个模型系统。需要注意的是，Asn131^3.35Ala突变是非活性的而Asn131^3.35Val突变部分保持了“钠离子效应”，维持了Gα_i的活性，虽然与野生型δ-OR相比激动剂的结合降低（图4a，补充表2）。这些数据说明在Asn131^3.35与钠离子之间相互作用的完全破坏会诱导非经典β-arrestin信号传导的高水平持续活性，而同时破坏经典G-蛋白的信号传导作用，从根本上诱发从Gα_i蛋白途径到β-arrestin途径的“有效性转换”。这些结果揭示出非保守性Asn131^3.35残基在控制δ-OR功能选择性和持续活性方面的必要作用，这种作用可能通过其在对别构性钠离子提供配位的结构性作用实现的。我们还对钠离子δ-OR突变株的基础性Gα_i蛋白活性进行了比较（扩展数据图7），发现与野生型相似，突变株具有类似的持续性Gα_i活性，其中Asn314^7.49Ala突变株有微弱增加而Asn131^3.35Ala突变株和Asn131^3.35Val突变株有微弱减少。在Asn131^3.35Ala和Asn131^3.35Val突变株中所见到的β-arrestin偏好性的强活性可能通过置换Gα_i蛋白对这种微弱减少起作用。

Figure 3 | Effectof sodium site mutations on sodium allosterism andβ-arrestin constitutive activity.
a,b,The effects of graded doses of sodium onDADLE affinity were measured at wild-type (a) and D95A mutant (b). Resultswereanalysed using the allosteric model summarized in Table 1.
c,The basalactivityof Asn131^3.35Ala and Asn131^3.35Val is compared to wildtype (WT)overa range ofDNAdosagesand their activity exceeded the one achieved with asaturatingconcentration of DADLE (10 uM) at wild type (open square).Receptorswere expressed at comparable levels (wild type, 226–758 fmol/mg;Asn131^3.35Ala,77–553 fmol/mg;Asn131^3.35Val, 176–715 fmol/mg).Results represent average±s.e.m.froma minimum of 64 replicates from arepresentative assay.
d, Mutants Asn131^3.35Ala andAsn131^3.35Val respondedto DADLE (10 uM) with a modest degree ofstimulation (*P<0.01 (t-test)versusno drug addition (basal)). Low-level expression was used allowing thedetectionof activation by a saturating concentration of DADLE.
图3 钠离子位点突变对于钠离子别构效应以及β-arrestin的持续性活性的影响
a，b，分级的钠离子剂量对于DADLE的亲和性在野生型（a）和D95A突变株（b）上的影响。通过概括在表1中的别构性模型对于结果进行分析。
c，对于不同DNA剂量的基础性活性在野生型和Asn131^3.35Ala和Asn131^3.35Val突变株之间的比较，以及当野生型在饱和性DADLE（10uM）浓度下所达到的活性，两个突变株与之相比有所增加。所有受体的表达处于可比较的水平（野生型226-758fmol/mg；Asn131^3.35Ala突变77-553fmol/mg；Asn131^3.35Val突变176-715fmol/mg）。结果代表均值±s.e.m.，数据来自至少64次重复的一次代表性检测。
d，与没有加药相比（基础水平），Asn131^3.35Ala和Asn131^3.35Val对于DADLE（10uM）的应答具有中等程度的刺激作用（*P<0.01，t-检验）。使用低水平表达从而使饱和浓度DADLE下进行激活作用检测。
钠离子依赖的阿片药理学
我们接着对Asp95^2.50进行了检测，这是另一个重要的钠离子位点残基，结果发现将这一残基突变为丙氨酸或天冬酰胺会在放射性配体结合实验中破坏“钠离子效应”（图3b，表1）。之前有报道说明小分子激动剂BW373U86是一种具有选择性的正构性δ-OR激动剂，其与受体的结合作用很少受到钠离子的影响。结果与野生型相比，在固定钠离子的位点突变株上BW373U86显示出在G蛋白和β-arrestin的信号传导作用少量到一定程度的减少（图4a，b）。另一方面，多肽性激动剂DADLE在δ-OR的Asp95^2.50Ala突变株上对β-arrestin的征募作用能力降低，并对于Asn310^7.45Ala和Asn314^7.49Ala突变株都表现为非活性状态，同时在G蛋白激动剂有效性方面显示少量到中等程度的减少（补充表2）。重要的是，我们发现经典的δ-OR配体含有一个环戊烯功能性基团（naltrindole，naltirben和BNTX），这些基团与野生型δ-OR结合并没有显示出对于β-arrestin途径明显的激动剂活性，在Asp95^2.50Ala钠离子位点突变株上获得强有力的偏好于β-arrestin的激动剂活性（图4d，补充表2）。当钠离子位点Asn310^7.45和Asn314^7.49残基被突变为丙氨酸后会见到类似的转化型效应（图4d，补充表2）。这些拮抗剂或弱的部分激动剂通过在别构性钠离子位点上的突变向偏好于β-arrestin的激动剂的转变与前述的Asn131^3.35突变的效应一起揭示了在δ-OR中我们称之为“效应转换开关”的实质。这些效应转换开关与之前报表的只会使G蛋白信号传导作用提高的效应转换开关明显不同。
在此以原子水平详细描述的别构性钠离子结合口袋可能会成为一个具有吸引力的药物发现目标。虽然小分子别构性调节剂在这一高度保守位点上的结合作用不太可能具有理想的亚型选择性，但将选择性正构配体扩展到钠离子空穴中可能会导致具有新型药理特征的双向性（bitopic）化合物出现，比如反式激动作用或强功能偏好性。晶体结构的细节可能还会有助于确认结合位点，以及对其他类型正向性别构调节剂（PAM）化合物如最近在参考文献15中所提到的化合物的作用模式具有启迪的意义。
Figure 4 |Sodium-coordinating residues forman efficacy switch regulatingbiased signalling. Mutationof the sodium-anchoring residues Asp95^2.50,Asn310^7.45and Asn314^7.49 promotes efficacy switching of thecyclopentenecontainingantagonist naltrindole into a potent β-arrestin-biased agonist.
a–d, Normalized concentration-responses of δ-OR-mediated Ga_isignallinginducedby BW373U86 (a)and naltrindole (c),and δ-OR-mediatedβ-arrestinrecruitmentwith BW373U86 (b)and naltrindole (d)were quantified as inMethods. Results represent average±s.e.m.of four independent experimentseach in quadruplicate and are presented aspercentage of activation byBW373U86. Receptors were all transfectedwith 15 ug DNA revealing weakpartial agonist activity of naltrindole atGa_isignalling as describedpreviously.
图4 对钠离子提供配位的残基形成一个效应开关对偏好性信号传导进行调控。固定钠离子的残基Asp952.50、Asn3107.45和Asn3147.49的突变促进将含有环戊烯的拮抗剂naltrindole转变为有力的对β-arrestin偏好的激动剂。
a-d，由BW373U86（a）和naltrindole（c）诱导的，δ-OR介导BW373U86对β-arrestin的征募（b）或naltrindole对β-arrestin的征募（d）的δ-OR介导Gαi信号传导作用的归一化处理后的浓度应答。结果代表均值±s.e.m.，基于四次独立实验，每次三重重复，并按BW373U86激活的百分率来表示。受体均由15ug显示对于Gαi信号传导作用的naltrindole的弱部分激动剂活性如前述。
我们的结果揭示出在特华GPCR信号传导及药理性质中别构性钠离子固定残基的必要的以及意义深远的作用。在别构位点上对固定钠离子的残基进行突变不仅会选择性地调节激动剂的结合，而且会通过增加β-arrestin的持续活性显著性地改变GPCR的功能活性并对于偏好性信号传导作用引入新的模式。特别要说明的是，这些发现强调了作为效应转换开关的对钠离子提供配位的氨基酸在GPCR信号传导中的出乎意料的必要性作用。（全文完）