【讨论】关于DCFA-DA检测细胞内ROS活性氧水平的相关实验，欢迎大家补充！

最近一直在做用DCFH-DA（2, 7-二氢二氯荧光黄）来检测细胞内活性氧水平实验，遇到很多问题，现在也还在摸索中。所以对于自己遇到的问题和还未解决的问题作以总结，欢迎大家多指导！
首先，我实验步骤如下：

一、细胞预处理

1细胞在做实验前两天，要把它的状态调到最好，细胞数量要到达1-2*106/ml均可（每次不能做太多样品，不然会ROS检测的不准，一次最多做6个样品）。

2每个处理组取500μl细胞（2*106），设置Blank Control（不加任何处理只有细胞的对照组），Negative Control（只加探针的对照组）。

3实验统一最后装载探针。

二、上机前细胞处理

1加药：细胞计数后，计算好所用培养基体积。300G，5min离心去掉之前的培养基后，加入新培养基，转移细胞至24孔板中，加药处理。阳性对照一般为H2O2（50μM）刺激30min，但可根据不同细胞对活性氧刺激反应不同而调整时间及浓度（H2O2最好每次现配）。

2无血清处理：药物处理时间到达后，将所有实验组细胞转移至EP管中，用无血清培养基洗一遍，300G，5min，后加入新无血清培养基500μl。

2装载探针：加入探针，加好后用*吹打均匀，37℃孵育20min，每5min颠倒一次。

3洗掉探针：PBS洗2次后（必须确定每次都洗2次或3次，不然会对结果有影响），上机检测。

DCFH-DA的激发波长为488nm，反射波长525nm，跟FITC的参数设置基本一致。

如采用荧光酶标仪进行检测，只需最后将细胞混匀后取出取平行三孔100μl加入96孔板中，放入酶标仪中检测即可（现在是用四壁为黑色板检测，我准备用普通96孔板检测试试看可否）。
用普通96孔板似乎是不行，我看好像是导致没加探针组变高了很多，应该是没有黑壁挡着，结果后面有荧光的处理组影响对没加探针组了，所以不能用普通96孔板了！！！

在使用酶标仪检测时，我之前没有选中Cutoff 515结果数据是不成趋势的。这次选中这个选项，结果就好了。而且跟流式结果基本是一致的。

在我的细胞中，结果中Blank Con平均荧光强度应该在2%以下，Negative Con应该在10-30%左右，H2O2（50μM）30min刺激应该在前者基础上加10%左右（仅供参考）。

我也用了荧光显微镜观察了结果，但好像没有发现荧光，可能是荧光太弱，如果有哪位前辈使用荧光显微镜检测过这个DCFH-DA的荧光，请不吝赐教！
下面是一篇关于DCFH-DA的比较基础文献，供参考！