【求助】遇到大麻烦了,将一个3.1k的片段连入4.5k的载体,请教各位有没有什么好方法
情况如下:
片段K,大小3.1k,已经连接入T载体,并测序正确。
载体A,大小4.7k,此载体为AAV载体(2型单链)pAAV-MCS,其最大装载容量4.7k,有国外文献报道可以装载5.2k的表达质粒。其说明书上说,最大插入片段为3k(按病毒包装上限,也就是两个ITR之间的序列)。我计算了一下,载体自身ITR之间的序列(包括CMV,beta globin intron和hGH pA)大小为1758bp,加上我的片段4815bp。
更为严重的是,老板让两星期搞定,目前手头没有其他的载体,改造载体(替换短的终止序列)也不太现实。拿给公司去做,没有任何一个公司敢接。
目前,我已经用紫外分光光度计定量了回收载体和片段,精确算出其摩尔数,考虑到是大片段连接,位阻效应比较严重,所以采用载体0.03pmol:片段0.3pmol的比例进行了12小时,24小时和48小时的连接、转化,结果只有24小时的有克隆,但是鉴定都为假阳性。
感受态用的是全式金的九次方转化效率的T1,连接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0,阳性对照和阴性对照没有问题。
下一步我打算用载体和片段的摩尔比梯度试一下。
各位有什么好的建议,好的经验,或者有哪位仁兄做过类似的试验,还请多多赐教!

最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1644