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β纤维蛋白原-455G/A基因多态性与阿司匹林
抑制血小板功能的关系研究
一、  选题的目的和意义
阿司匹林作为一种有效的血小板聚集抑制剂，已广泛用于心、脑血管血栓性疾病的防治。但是服用阿司匹林的不同个体，其治疗反应性却有差异,甚至出现阿司匹林抵抗性。国内外新近研究报道，β纤维蛋白原基因-455、-448、-148多态性与血浆纤维蛋白原水平有关，而且几乎完全连锁，血浆纤维蛋白原水平与血小板聚集有关，但有关血小板聚集功能、阿司匹林抑制血小板聚集效应差异性与β纤维蛋白原基因多态性关系的研究，国内外尚无报道。
本课题的完成将揭示β纤维蛋白原基因多态性与血小板聚集功能、阿司匹林抑制血小板聚集效应差异性是否具有相关性，阐明不同个体对阿司匹林反应差异性甚至抵抗的原因，为阿司匹林个体化治疗提供依据。
二、立题依据

血小板在动脉粥样硬化性心血管病血栓并发症中起重要作用。血小板的主要作用是在血管损伤部位形成血栓。当发生出血或血管病变时，在病变的血管表面发生血小板聚集是生理及病理性的血栓形成的主要反应。与血小板血栓形成相关的过程包括：血管损伤部位血小板黏附和血小板聚集。血小板发生彼此黏附现象，称之为聚集，纤维蛋白原在血小板聚集过程中起重要作用，其质和量直接影响血小板的聚集功能。参与血小板聚集的主要成分包括血小板膜糖蛋白GPIIbIIIa复合物、纤维蛋白原和钙离子。血小板GPIIbIIIa是血小板聚集反应的最终效应受体，它与纤维蛋白原或vWF结合导致血小板的聚集。在受损伤的血管壁处暴露的内皮下组织及组织中释放的血小板活化剂引起血小板活化，血小板表面GPIIbIIIa分子活化构型发生改变，受体暴露，使纤维蛋白原分子与二个血小板结合，形成血小板集体网格。正常循环中的血小板不能与血浆纤维蛋白原结合，只有当血小板活化时才能与纤维蛋白原结合，形成血小板--纤维蛋白原`--血小板结合状态，即血小板聚集，成为导致血小板性血栓形成的最后通路。
ADP 肾上腺素 凝血酶 黏附（胶原）

释放AA

环氧化酶
释放ADP
血清素
血栓烷A2（TXA2）

GPIIbIIIa暴露

（血小板-纤维蛋白原-血小板）

血小板聚集

纤维蛋白原（fibrinogen）是血浆中最早分离出来、含量最高的一种蛋白质，由肝脏合成，分子量330，000—340，000，含有三对多肽链（Aα,Bβ,γ）2，由二硫键连接，Aα,Bβ,γ链的分子量分别是66kD、52 kD、46 kD，分别由610、461、411个氨基酸组成，三条多肽连分别由各自不同的基因编码，但3个基因均位于第4号染色体长臂（4q23-q32），基因总长度50kb。在纤维蛋白原合成过程中，纤维蛋白原Bβ链的合成是整个过程的限速步骤，而影响纤维蛋白原表达的主要是编码β链的基因。 目前认为纤维蛋白原基因中共有10多个多态位点，通过用等位基因限制性内切酶酶切技术和聚合酶扩增技术已证实Bβ链-148C/T、448G/A、-455G/A位点多态性与血浆纤维蛋白原水平有关，而且-148T、448A、-455A 或-148C、448G、-455G分别紧密连锁不平衡，符合率超过97.44-98%,故可用β纤维蛋白原启动子区-455G/A多态性与血浆纤维蛋白原水平关系代表-148C/T、448G/A多态性对血浆纤维蛋白原水平的影响，许多研究证实血浆纤维蛋白原水平呈-455GG〈-455GA〈-455AA，但-455G/A多态性与冠心病、脑血栓等动脉血栓性疾病的关系不一致，部分研究认为-455A为冠心病、脑血栓等动脉血栓性疾病的危险因素，部分研究未以与证实。
阿司匹林是最常用的血小板抑制剂，它可与环氧化酶活性部分丝氨酸残基发生不可逆的乙酰化反应，使酶失活，抑制花生四烯酸代谢，减少对血小板有强大促聚集作用的血栓素A2（TXA2）的产生；环氧化酶的抑制也可抑制血管内皮产生对血小板有抑制作用的前列环素（PGI2）。阿司匹林对血小板中的环氧化酶的抑制是不可逆的，只有当新的血小板进入血液循环才能恢复，血管内皮中环氧化酶因DNA合成而较快恢复。阿司匹林的主要不良反应是诱发消化性溃疡及消化道出血。不同的个体对阿司匹林的反应性不同，尚有个体出现阿司匹林抵抗，其分子生物学机制可能与某些基因多态性有关。目前用于心血管疾病一级或二级预防的阿司匹林最佳用量目前仞然存在很大争议，口服剂量相差较大。为了达到最佳治疗效果，最小的副作用，临床上应采取个体化治疗方案，但采取个体化治疗目前无据可循。
目前，已经确定-455G/A多态性与血浆纤维蛋白原水平有关，而血浆纤维蛋白原与血小板聚集功能相关，因此可以假定-455G/A多态性可能影响血小板聚集功能，及药物抑制血小板聚集的敏感性，但目前尚未见到-455G/A多态性与血小板聚集功能及药物抑制血小板聚集的敏感性差异相关性的报道。
基于上述分析，本课题拟用分子生物学技术及血小板聚集仪探讨阿司匹林在体内抑制血小板作用的差异性与β纤维蛋白原基因-455G/A多态性的关系，以及β纤维蛋白原基因-455G/A多态性与血小板聚集性之间的关系，阐明不同个体对阿司匹林反应差异性甚至抵抗的原因，为阿司匹林个体化治疗提供依据。
二、  研究内容
a)  研究目标
i.  β纤维蛋白原基因-455G/A多态性是否与血小板聚集功能有关。
ii.  β纤维蛋白原基因-455G/A多态性是否与阿司匹林抑制血小板作用的差异性有关；
b)  研究内容
i.  DNA抽取试剂盒抽取外周血白细胞基因组DNA。
ii.  用PCR-RLFP确定β纤维蛋白原基因-455基因基因型。
iii.  用血小板聚集仪检测口服阿司匹林前后血浆纤维蛋白原及血小板聚集功能。
iv.  比较健康人在口服阿司匹林前后血小板聚集功能、纤维蛋白原差异性是否与β纤维蛋白原基因-455G/A多态性相关。
四、研究方法
（一）  拟采用的主要研究方法
1、DNA的PCR扩增
2、RLFP后溴化乙啶凝胶电泳、紫外线显像
3、全血电阻抗法测定血小板聚集功能
4、Clauss法测定血浆纤维蛋白原含量
5、X2检验与t检验
（二）实验方法与技术路线
实验对象：健康人N=100，男女各50人，年龄20—65岁，所有对象第一次抽血时的前一周未服用抗血小板及影响血小板功能的药物，空腹采血肝素抗凝血100-200 ul，测定β纤维蛋白原基因型。3.84%枸橼酸钠1:9抗凝血3ML，检测血小板聚集功能、血浆纤维蛋白原含量。测定β纤维蛋白原基因型后选取GG、GA、AA基因型对象各20例口服阿司匹林100mg24小时后抽取3.84%枸橼酸钠1:9抗凝血2ML(3小时内24-27。C) 检测血小板聚集功能。

空腹采血

肝素抗凝血100-200 ul 3.84%枸橼酸钠1:9抗凝血
抽取DNA 2ML(3小时内24-27。C)
2500R/分常温离
测定β纤维蛋白原基因型 检测血小板聚集功能 离心12分钟，除
去血小板，分离
选取GG、GA、AA基因型对象各20例 血浆分装在聚乙
口服阿司匹林100mg24小时后抽取 烯小试管中，置
3.84%枸橼酸钠1:9抗凝血2ML(3小时内24-27。C) -20。C冰箱保存。
检测血小板聚集功能 血浆纤维蛋白原含量
1、测定β纤维蛋白原基因型：
DNA抽取：全血DNA抽取用大连宝生物公司的全血DNA抽取试剂盒提取DNA，含试剂：溶液I、II、III
（1）方法：肝素处理全血100ul，加入溶液I 0.5ml(破坏血细胞同时与核酸形成中性复合物)，旋转（VORTEX）数秒，室温放置10分钟以上，12000G离心5分钟，除去上清，加入溶液II 1ml，轻轻颠倒混合2-3次，12000G离心2-5分钟，除去上清，加入溶液III 0.5ml(将DNA分离出来)，旋转10秒钟，12000G离心5分钟，将上清移入新离心管中，与等量的异丙醇混合(沉淀回收DNA)，充分颠倒混合，12000G离心5分钟，除去上清，70%乙醇清洗，简单干燥(不要使DNA完全干燥)，用TE溶解(一般需要12-24小时，按5×106个细胞提取物加1毫升TE(PH8.0))（100 ul全血含有0.4--1.0×106个白细胞），得到精制的DNA。（离心力g=1.119×10-5 ×R(厘米) ×转速2(r/min)2）
DNA贮存：最好溶于TE中4。C保存。
（2）测定DNA样品在260nm和280nm的OD值，计算DNA含量和A260/A280的比值，判断DNA的纯度，若有必要可用脉冲电泳（PFGF）观察DNA片断大小。(核酸最大紫外线吸收值260nm，吸收低谷230nm，A为260nm、G为276nm、T为264.5nm、C为267nm，波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50 ug/ML，在260nm和280nm的紫外线吸收值比值（A260/A280）估计核酸纯度DNA为1.8，RNA为2.0，若DNA比值高于1.8，说明制剂中尚有RNA。紫外分光度法仅适用于测定浓度大于0.25 ug/ML的核酸溶液。
仪器：带氩灯的分光光度计，使用前预热稳定10分钟。
步骤：
a)  吸取5 ulDNA样品，加水至1ML混匀后，转入光度计的石英比色杯中。如果样品很少，可以用0.5ML比色杯，核酸样品及水容积均缩小一半。
b)  分光光度计先用1ML水校正零点。
c)  在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品浓度为ug/ ul=OD260×核酸稀释倍数×50/1000
d)  若为DNA样品，A260/A280大于1.8说明仞存在RNA，可以用RNA酶处理，小于1.6说明样品存在蛋白质和酚，应再用酚/氯仿抽取，用乙醚抽取后，以乙醇沉淀纯化。
B、DNA扩增：引物设计：上游引物：5，-CACTTACTGGGATTTGGATTAC-3，，下游引物：5，-GGCTGAACCATTTTATCATTTA-3，， 50ul的反应体系中，含有DNA模板3ul（约0.5 ug），10×Ex Taq Buffer缓冲液5ul， MgCL24ul(2.5mmol/L)，dNTP 4ul(各2.5mmol/L)，Ex TaqDNA聚合酶0.25 ul（5u/ ul），下游引物0.5 ul(0.5u mol/L)，上游引物0.5 ul(0.5 u mol/L) ，灭菌蒸馏32.75ul。
扩增程序为94。C预变性5分钟后进入循环；94。C变性30秒，60。C复性30秒，72。C延伸30秒，共30个循环，72。C延伸5分钟，4。C水浴60分钟。（说明书94。C30秒55。C1分钟72。C5分钟）
50ul的反应体系：DNA模板3ul（约0.5 ug） Ex TaqDNA聚合酶0.25 ul(5u/ ul)
10×ExTaqBuffer缓冲液5 ul 灭菌蒸馏水32.75 ul
下游引物0.5 ul(终浓度0.5u mol/L)上游引物0.5 ul(终浓度0.5u mol/L)
MgCl24ul(25mmol/L) dNTP 4ul(各2.5mmol/L)
C、电泳分型：取15ul PCR扩增产物加限制性内切酶HaeIII10-20u及相应缓冲液，37。C水浴消化2小时后，经2%溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶在80—100V电压下电泳60分钟，紫外灯下观察记录结果并拍照。若出现133bp、382bp、350 bp则为Bβ-Fg-455G/G基因型，若只出现133bp 、732bp则为Bβ-Fg-455A/A基因型，若133bp、732bp 、382bp、350 bp同时出现，则为Bβ-Fg-455G/A基因型。
制备凝胶：
1、2克琼脂糖，加入盛有100ML 0.5×TBE电泳缓冲液的三角瓶中，液体不要超过三角瓶1/2容积，以1/3容积为好，用滤纸（如新华5号）塞于瓶口，留出缝隙，以防瓶盖在加热时被蒸汽冲开，或用两层保鲜膜盖于瓶口。
2、微波炉加热或沸水浴使琼脂糖溶解，注意微波炉加热在2分钟左右即可使琼脂糖溶解，时间太长会使水分蒸发过多改变凝胶浓度。
3、溶液冷至60。C时，加入50 ug溴化乙锭（至终浓度0.5 ug/ML）（溴化乙锭有毒，必须带手套操作）
4、制胶模具的两端用医用橡皮膏封好，再在其边缘加上少量琼脂糖溶液，凝固后有防渗漏作用。
5、将琼脂糖倒入模具。凝胶厚度为0.3-0.5CM，迅速在模具一端安插上梳子，检查有无气泡。梳齿直接接触模具底面或与它们之间的距离太近，在取出梳子时，容易将孔底凝胶拉破，导致样品泄漏到胶与模具之间，
6、室温下30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，低熔点胶应于4。C凝固，小心取出梳子，撤除模具两端的橡皮膏，将凝胶放置于电泳槽中。
7、加入0.5×TBE电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1毫米，这样凝胶两端的电压几乎与外加电压相等，电泳效率高。电泳槽中的缓冲液与凝胶配置的缓冲液应为同一批配置，若电泳缓冲液与凝胶中的离子强度和PH值不一致将影响核酸的迁移。
8、在DNA样品中加入1/6 DNA上样缓冲液，混匀后，用Eppendorf离心机离心5秒种，使溶液全部汇集于管底部。
9、用移液*将DNA样品加入样品孔中。(DNA 2ul与0.4ul0.25%溴酚蓝混匀)
注意：
a)  加样时*头不要碰坏凝胶孔壁，否则DNA带型不整齐，加样前要用*头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品孔中的气泡，
b)  每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目、样品孔形状与容量。对于0.5CM宽的样品孔,电泳后每条DNA带宽最底检测量为2ng，若每条DNA带含有500ng的量，则会发生拖尾轮廓不清的超载现象。标准的0.5×0.5×0.15CM的样品孔,最大上样容积37.5 ul，加入含有许多不同分子量的20-30 ugDNA样品也不至于影响分辨率。
c)  DNA分子量标准应该在两侧的样品孔均加上。
10、接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，DNA样品向正极泳动。电压选择1—5V/CM（长度以两个电极之间的距离计算）
注意：A、电源接通前核实凝胶方向是否放置正确，
B、电泳仪仅有电压显示不一定标志电泳槽接通，观察正负极是否有气泡，负极气泡H2比正极O2多一倍表示电泳槽电源接通，几分钟可见指示剂溴芬兰向正极移动，
C、可用万用表测量电泳槽两极之间的实际电压，
D、电泳过程中，溴乙锭向负极移动（与DNA方向相反），长时间电泳造成靠正极的凝胶中EB含量低，对于小分子量DNA检测困难，这种情况凝胶重新在0.5ug/ML的EB溶液染色30-45分钟，
E、凝胶中加入EB电泳，可随时紫外灯下观察电泳状态，但EB会导致线性DNA迁移率下降15%，EB会影响DNA带的整齐，为获得整齐、扁平的DNA带型，可于电泳后EB染色。
11、根据指示剂迁移的位置判断是否中止电泳，切断电源后取出凝胶，EB染色（含EB的凝胶可直接紫外灯下观察结果并拍照记录）（EB可以嵌入DNA片段中，紫外灯下发出红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比）
凝胶照相：
设备：135相机、全色135胶卷、照相机固定架、紫外线透射仪（波长254、302、366毫米）、近摄镜、红光滤光镜
1、在暗室中将安装好胶卷和近摄镜片（1-3片）的相继固定在拍摄架上，
2、电泳后含EB的凝胶或EB染色的凝胶放于紫外线透射仪适当位置，
3、在凝胶旁放好一把有刻度的咫尺，并在一张小纸片上写明实验日期、姓名、编号，在普通灯光下以纸片上字迹为参照调好相机焦距，
4、在镜头前加上红光滤光片，关掉普通灯光，打开紫外灯（最好用302毫米波长）确认样品中条带在视野中的位置，用相机自动测光，确定暴光时间及光圈大小。
若无自动测光设备可把光圈固定在4或5.6位置，选择不同的暴光时间拍摄数张照片，摸索最佳暴光条件，暴光时间一般为10秒左右，较长的暴光时间可以检测出1 ng的DNA条带。
5、拍摄完毕，立即剪下已拍过的数张胶片，用D-76显影液冲洗胶卷，显影10分钟左右，后定影10分钟，检查拍摄效果，若暴光时间不佳，可重新调整条件进行拍摄。
对含EB的凝胶，操作时应戴手套，紫外线灯下观察或拍摄电泳结果应戴有机玻璃防护面罩。
溶液中EB的毒性淬灭：
EB是强致突变剂，操作时应戴手套，对含EB的溶液亦不应直接倒入下水道，下面方法可淬灭EB的致突变能力200倍左右。
1、用水将溶液中EB浓度稀释至0.5ug/ML以下。
2、加入1倍容积的0.5mmol/L的KMnO4，小心混匀，后加入1倍容积的2.5mmol/L的HCl，小心混匀，室温放置数小时。
3、加入1倍容积的2.5mmol/L的NaOH，混匀后即可废弃。
溶液配制：
1、0.5mol/L的EDTA（PH8.0）：800ML水+186.1克EDTA-Na·2H2O(二水乙二胺四乙酸二钠)，在磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH颗粒约20克调节溶液PH值至8.0，（EDTA-Na·2H2O需要加入NaOH将溶液PH值调至8.0时,才能完全溶解）然后定容（加水）至1L，分装后高压灭菌备用。
2、10mg/ML溴化乙锭(EB)：100ML水+1克溴化乙锭，磁力搅拌数小时确保其完全溶解，然后用铝箔箱包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温（使用时务必戴手套，称量时戴面罩）
3、TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl-1 mmol/L EDTA，取上述1 mol/L Tris 10ML，取0.5 mol/L EDTA 2ML,加水至1000ML，高压灭菌
不同
PH，1 mol/L Tris缓冲液
缓冲液  PH  Tris碱用量  水（ML）  浓盐酸（ML）  定容（ML）
1 mol/L Tris缓冲液  7.4  121.91克  800  70  1000
  7.6  121. 91  800  60  1000
  8.0  121. 91  800  42  1000
如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris，应使溶液冷至室温后方可最后调定PH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌（Tris溶液PH值因温度而异，温度每升高1。C，PH大约降低0.03）
不同PH，TE溶液
溶液    Tris  EDTA（PH8.0）
  PH  PH7.4  PH7.6  PH8.0  1 mmol/L
TE  7.4  10 mmol/L      
  7.6    10 mmol/L    
  8.0      10 mmol/L  
各种PH值的0.05 mmol/L Tris缓冲液的配制
50ML0.1 mmol/L Tris碱溶液与表中HCl混合,加水至100ML
所需PH值（25。C）  0.1mmol/L的HCl体积(ML)
7.1  45.7
7.2  44.7
7.3  43.4
7.4  42.0
7.5  40.3
7.6  38.5
7.7  36.6
7.8  34.5
7.9  32.0
8.0  29.2
8.1  26.2
8.2  22.9
8.3  19.9
8.4  17.2
8.5  14.7
8.6  12.4
8.7  10.3
某一特定PH值的0.05 mmol/L Tris缓冲液配制:将50ML0.1 mmol/L Tris碱溶液与表中相应体积的0.1mmol/L的HCl混合,加水至100ML
4、2%琼脂糖：2克琼脂糖，加入盛有100ML 0.5×TBE电泳缓冲液的三角瓶中，液体不要超过三角瓶1/2容积，以1/3容积为好，用滤纸（如新华5号）塞于瓶口，留出缝隙，以防瓶盖在加热时被蒸汽冲开，或用两层保鲜膜盖于瓶口。微波炉加热或沸水浴使琼脂糖溶解，注意微波炉加热在2分钟左右即可使琼脂糖溶解，时间太长会使水分蒸发过多改变凝胶浓度。
5、DNA上样缓冲液：0.25克溴酚蓝+40克蔗糖+100ML水（0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液），贮存4。C 。
6、TBE电泳缓冲液：5×：54克Tris碱、27.5克硼酸、20ML的0.5mol/L EDTA (pH8.0)加水至1L,使用时1:10稀释成为0.5×浓度。
7、HCl、NaOH、KMnO4
溶质  分子量  mol/L  克/L  配制1mol/L溶液1L的加入量(毫升)  2.5mmol/L HCl或NaOH  0.5mmol/L的KMnO4
HCl  36.5  11.6  424  42.7    
    2.9  105  86.2    
NaOH  40  19.1  763  52.4    
    2.75  111  363.4    
KMnO4            

所需试剂：
l  上游引物：5，-CAC TTA CTG GGA TTT GGA TTA C-3，
下游引物： 5，-GGC TGA ACC ATT TTA TCA TTT A-3，
l  ExTaqDNA聚合酶（DRR01AM×1） =400元
10×ExTaqBuffer缓冲液（100mM Tris-HCl(pH8.3) 500mM KCl ）
MgCL2
dNTP
l  灭菌去离子水
l  大连宝生物公司的全血DNA抽取试剂盒（D9081×2） =1200元
Genome DNA Extraction Kit室温保存，溶液I在4。C保存会产生沉淀，用于全血抽DNA，40分钟完成。

各种溶液使用量  溶液  使用的Tube规格
从全血提DNA  I  II  III  
100ul  0.5ML  1 ML  0.5 ML  1.5 ML
1 ML  5 ML  10 ML  5 ML  10 ML
2 ML  10 ML  12 ML  7 ML  15 ML

Protocol
血液处理量  供血者  A260/280  提取量ug  DNA收量ug / ML
100ul  柠檬酸  A  1.97  2.2  22
  肝素  A  1.92  3.6  36
  EDTA  A  2.02  2.5  25
1ML  柠檬酸  B  1.74  15.3  15.3
  肝素  B  1.64  8.2  8.2
  EDTA  B  1.79  13  13
2ML  柠檬酸  B  1.97  35.8  17.9
  肝素  B  2.05  19  9.5
  EDTA  B  2  31  15.5
标准方法不必经过Rnase处理，就可去除RNA。1ML血液加入0.1-0.2 mg肝素，提取DNA没问题。于－80。C保存的血液仞可提取，但如果反复冻融，收量纯度都会下降。提取的DNA片断大小约50Kbp以上。
l  DNA marker (D501A×1) =200元
l  限制性内切酶HaeIII(D1051A×1)(含反应停止缓冲液) (缓冲液M、H、T+BSA或 Basal) =120元
酶切位点GG CC ，酶浓度4-12 u/ ul，反应温度37℃
CC GG
l  溴化乙锭(EB)（85元/100mg）
l  琼脂糖（ 350元/100g）
l  TE
l  DNA上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液）
贮存4。C ，以0.5×TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的泳动速率约与300bp的双链线状DNA相同
l  电泳缓冲液TBE（5×：54克Tris碱、27.5克硼酸、20ｍｌ 0.5 mM EDTA (pH8.0)/L,使用时1:10稀释成为0.5×）
溴酚蓝（150元/10 g） 蔗糖（85元/200 g） Tris碱 硼酸 EDTA-Na·2H2O NaOH颗粒 HCl 矿物油（90元/5 ML） 异丙醇 70%乙醇 无水乙醇D-76显影液
2、检测血小板聚集功能：用全血电阻抗法测定血小板聚集功能
所用标本为 1∶9枸橼酸钠抗凝血 2ML，所有试验用CHRONO-LOG590型全血血小板聚集仪在 3小时内完成，进行不同诱导剂的血小板聚集试验测定花生四烯酸和ＡＤＰ两项诱导聚集率。
所需试剂：
l  ＡＤＰ（1ｍｌ×3=480元）
l  花生四烯酸（1ｍｌ×3=600元）
l  胶原（1ｍｌ×3=300元）
3、检测血浆纤维蛋白原含量
用PPP即可，因为血浆纤维蛋白原含量检测要求2500R/分常温离心12分钟，除去血小板，分离血浆分装在聚乙烯小试管中，置-20。C冰箱保存。用前室温放置30分钟，因研究表明融化后的血浆，与新鲜血浆测定的Fg值相差-1.6%到5.7%之间,中位数为1.1%,可略而不计。可用克劳斯法（von Cluss法）、PT-der法、免疫浊度法、热浊度法、亚硫酸钠盐析法。克劳斯法（von Cluss法）、免疫浊度法为功能测定法，克劳斯法（von Cluss法）为目前国外最常用的常规方法。
三、  观察指标
a)  β纤维蛋白原基因型
b)  用药前血浆纤维蛋白原含量Fg
c)  用药前、后血小板聚集功能
d)  血压
e)  体重指数
f)  腰臀比

β纤维蛋白原基因与阿司匹林抑制
血小板功能关系调查表 编号
姓名：  性别：  年龄  民族：
身高： CM  体重： KG  体重指数：  吸烟否： 现 年 支/天
血糖  血压 mmHg   腰臀比  父母是冠心病史 否 有
胆固醇：  甘油三脂  低密度脂蛋白  高密度脂蛋白
脂蛋白a  载脂蛋白AI  载脂蛋白B  饮酒 两/天 年
诊断：
健康对照 是 否  口服阿司匹林前  口服阿司匹林后
血小板计数PLt    
血小板平均体积MPV    
血浆纤维蛋白原含量    
血小板聚集功能  ADP诱导    
  花生四希酸    
β纤维蛋白原基因型