【求助】关于 HIS标签的 柱上切割 （凝血酶 肠激酶 ）

想请教一下：

我用表达了一个蛋白，想把它在N 端的HIS标签去掉得到绝对的纯品，开始酶切位点设计为 肠激酶 ，过柱 纯化后 电泳显示一直为有 紧贴 的杂带，估计可能 蛋白C端 易断裂 ，所以 又 将位点设计为 C端 的凝血酶 ，问题解决

但 无论是 凝血酶 还是 肠激酶 ，我在 CO柱 上的 酶切效果都不好 ，肠激酶是 室温过夜 ，凝血酶是 4度过夜 ，但 第二天收集 柱中的酶切液 均发现 没有蛋白 ，用洗脱液可以洗脱下来 ，也就是没切 动 蛋白 ，两次的酶切缓冲液 均为 PBS，想请问 一下，问题出在哪里 ，应该注意些什么？