【求助】帕金森病动物实验问题总汇，急盼各位高手赐教！

做帕金森病动物实验4月余，进展不大，问题繁多，现总汇发帖如下，望各位高手不吝赐教，不胜感激！

实验方法：8周大小的雄性C57BL/6 小鼠，20mg/kgMPTP腹腔注射,bid*2d,打药间隔为12小时。行为学检测包括爬杆试验和locomotive activity.测定时间分别为打药后3d,7d,14d.动物于MPTP注射后14天以0.1M PBS灌流，断头取脑,于冰上将脑组织纵向半切，半脑置于4%PFA中固定两天，经30%蔗糖脱水2d后OCT包埋，冰冻切片，做黑质部分的TH免疫组化。另一半脑组织，迅速于冰上取纹状体做HPLC,测定多巴胺及其代谢产物的含量。
问题：
行为学方面，所有的行为学检测，无论是rotarod,还是locomotive activity,从头到尾，没有差异，而纹状体组织的HPLC显示多巴胺含量下降约50%。看过文献，绝大部分报道MPTP模型会recover,行为方面尤其显著，recover的pattern,各文献报道不一。那么MPTP注射后，选择哪个时间点测定行为比较好呢？3d 我以为已经是很近了。在测定爬杆试验时，我是让小鼠先在静止的杆子上呆1-2min,然后5rpm的转速适应30s,再加速，记录其在杆上的停留时间。每个老鼠连续测定3次，取平均值。感觉动物个体之间变异很大，而且同一个老鼠，每次爬的结果也可能很不同，比方说，一个老鼠连爬3次，第一次爬了90s,第二次40s就掉下来了，第三次又爬了个80多s,感觉第二次就不太能代表它的实际水平，但如果让它重爬一次的话，经过训练，老鼠suppose会越爬越快，好像又不太准。这个行为，有什么比较好的方法以减少变异呢？师姐说她以前做行为的时候，正常的老鼠不用怎么训，至少可以爬个90s,甚至2-3min.我的老鼠跟她一个种系，一个性别，用的同样的设备检测，方法我也严格的follow她的，训了两三天还是绝大多数都50-60s就掉下来了，很少有超过90s的。另外有一批12周的老鼠，也是雄性C57BL,爬杆子的能力好像就比这些8周的强一点，不太怎么训就可以爬个1min.是不是不同年龄的老鼠，本身爬杆子的能力就不同呢？哪位有做过这方面比较的吗？
还有让我更为困惑的一点，从DA的测定来看，打了MPTP的老鼠个个都是降低的，但在切片做免疫组化的时候，MPTP组（总共5只）中有两只老鼠TH细胞很多，和正常没有什么两样，DA 与TH 为什么不匹配呢？
TH免疫组化也存在一些问题，片子上空泡很多，包括阳性细胞里面似乎也都是空泡(见图），有师兄建议用梯度脱水，现20% 蔗糖沉底后再30%蔗糖沉底。这次就用的梯度脱水，可是好像没有多大改善。到底问题出在哪里呢？灌流对它的影响大吗？还是切片的厚度有影响？还是其它？我切片的厚度是20um。灌流用的是0.1 M 冰冷的PBS, 每只老鼠大概灌了50ml左右。