【求助】PPIC9K转化过程的许多问题，谢谢！！（急啊，很久了）
这个帖子发布于 17 年零 302 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
目的片段1400左右，载体为PPIC9K，酶切位点为EcorI和NotI。质粒构建好后用SalI线性化，1500V电转入GS115。涂MD。挑斑于YPD，提基因组跑pcr鉴定，两个条带，大小符合。然后先在BMGY预培养，再转入BMMY，每24h添加甲醇1％。四天后监测，无蛋白，无酶活（脂肪酶）（当时BMGY跟BMMY培养基都忘记添加磷酸缓冲液了，在诱导到第2天的时候紧急添加的磷酸缓冲液）
请教以下问题：
1 PCR鉴定成功后，不能表达该怎么办？虽然这个问题涉及很多环节，可是是到如今，我该怎么办？换宿主菌KM71H？重新转化？
2 刚开始诱导时，培养物有一股酵母的酸甜味道。可是诱导到第二天以后，酸甜味道逐渐降低，反而产生了一种浓重的说不出的味道，是不是甲醇的量太大了，是甲醇的味道？
3 我诱导时甲醇添加量为每24h添加1％，是不是应该每12h添加0。5％？一次性添加1％会不会导致部分诱导出的蛋白变性？
4 为什么甲醇添加量是一成不变的？刚开始酵母菌浓度低，添加量应该少一点，可是后来酵母浓度变的很高了，还是添加1％合适嘛？同时还有取样的因素，导致体积逐渐减少。是不是应该在二者之间找个平衡点？
5 BMMY里面的磷酸缓冲液达到100mmol/L,浓度是不是太高了？
请各位战友指教啊！！
请教以下问题：
1 PCR鉴定成功后，不能表达该怎么办？虽然这个问题涉及很多环节，可是是到如今，我该怎么办？换宿主菌KM71H？重新转化？
2 刚开始诱导时，培养物有一股酵母的酸甜味道。可是诱导到第二天以后，酸甜味道逐渐降低，反而产生了一种浓重的说不出的味道，是不是甲醇的量太大了，是甲醇的味道？
3 我诱导时甲醇添加量为每24h添加1％，是不是应该每12h添加0。5％？一次性添加1％会不会导致部分诱导出的蛋白变性？
4 为什么甲醇添加量是一成不变的？刚开始酵母菌浓度低，添加量应该少一点，可是后来酵母浓度变的很高了，还是添加1％合适嘛？同时还有取样的因素，导致体积逐渐减少。是不是应该在二者之间找个平衡点？
5 BMMY里面的磷酸缓冲液达到100mmol/L,浓度是不是太高了？
请各位战友指教啊！！
