【求助】细胞荧光染色后出现一些问题，疑与固定有关，请帮忙解决

我用95％乙醇10min固定贴壁细胞，采用0.1%trion100 打孔7min，随后按常规行免疫荧光检测（抗原在细胞核）
出现问题：
1.贴壁的细胞出现局部隆起，似脱离培养板，这些隆起的部分未被染色。
2.有些细胞（多为板中央的细胞）失去正常形态，似细胞破裂，而且不见细胞核，荧光下出现胞膜的非特异性染色。
3.孔周边的一些生长紧密的细胞的染色效果最好，很少出现“细胞破碎”的现象。
请教：问题1与固定时间和固定剂的选择有关吗？
问题2和0.1%trion100打孔时间有关吗？我用的浓度和时间和参考文献相同。
另外，由于细胞种植的浓度偏低，细胞生长的状况欠佳，呈过度伸展状态，这是否影响trion100的结果？
望各位战友不吝赐教！