16种中成药微生物限度检查法方法验证
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16种中成药微生物限度检查法方法验证
[日期：2006-02-23] 来源： 作者：中检所抗生素室
含抑菌成分的中成药的微生物限度检查，必须消除供试液抑菌活性后，再根据中国药典规定的方法进行检查，同时，所采用检测方法需进行验证试验，以确认供试品的抑菌活性和保证测定方法的可靠性。因此，现行中国典收载的各中成药品种检查项下，很少规定具体的微生物限度检查方法。根据国家药典会的要求，中国药品生物制品检验所抗生素室和青岛市药检所微生物室，对2005版药典拟收载的16种中成药品种微生物限度检查法进行方法验证，为规范中成药的微生物限度检查法提供科学依据。
材料和方法
1、材料
1.1仪器设备
净化工作台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃）、微波炉、康氏振荡仪、匀浆仪（300～8000r/min）、恒温水浴、电热干燥箱（250～350℃）、电冰箱、空调、高度蒸汽灭菌器、集菌仪、离心器、菌落汁数器、显微镜（1500x）、电子天平（感量0.1g）、免接触自动控制手消毒器
1.2玻璃器皿
锥形瓶（250～300ml）、平皿（9cm）、量筒（100m）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20或30ml）、注射针头、载玻片、可折卸滤器及微孔滤膜（0.45μm）均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用
1.3用具
一次性无菌衣、帽、口罩、手套、大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并定期用70%～75%，乙醇溶液浸泡）、接种环（白铱金、环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球及碘伏棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、研钵（陶瓷制、直径10～12cm）、洗手盆、实验记录纸等。
1.4试液
1.4.1消毒液
0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用），5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内供消毒带菌吸管用）75%乙醇溶液、碘酊、碘伏溶液。
1.4.2稀释剂
0.9%无菌氯化钠溶液（稀释供试液及菌液用）
1.4.3培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基、硫乙醇酸盐琼脂培养基
1.4.4染色剂
甲紫染液（Hucker液）、革兰碘液、脱色液、番红复染液
1.5样品
厂家 批号
感冒清热颗粒 南宁维威制药 630801
黄连上清丸 陕西香菊制药 030202
牛黄上清片 佐今明制药 021202
感冒清片 广东罗浮山药业 030804
热炎宁颗粒 贵阳润丰制药 030401
清开灵口服液 山西太行药业 030904
清喉利咽颗粒 山西桂龙医药 030511
千柏鼻炎片 广东博罗先锋药业 020301
藿香正气滴丸 天津天士力制药公司 030340
三黄片 山西杨文水制药厂 030222
清热解毒口服液 江西新余制药厂 030422
板兰根冲剂 四川奇力制药有限公司 030422
复方丹参片 巢湖正大药业有限公司 020401
牛黄解毒片 上海正大药业有限公司 031125
三七伤药片 上海雷允上药业有限公司 030760
双黄连口服液 上海三洋药业健康产品有限公司 0301221
购自北京和青岛两地医药商店
1.6试验菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]
大肠杆菌（Escherichia Coli）[CMCC(B)44102]
枯草杆菌（Bacillus Sulticis）[CMCC(B)63501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]
黑曲霉菌（Aspeigillus niger）[CMCC(F)98003]
来自中国医学细菌保藏中心
2、方法
2.1菌液的制备
取经37℃培养18～24h，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌肉汤培养基1ml及20～25℃培养18～24h的白色念珠菌真菌液体培养物+9ml盐水为0倍稀释，以此类推，稀释到10-4～10-7为50～100个/ml做活菌计数备用，取经20℃～25℃培养一周的黑曲霉斜面培养物、加水3～5ml，洗下霉菌孢子，用带有棉花的球形吸管取出菌液，用标准比浊管比浊后，稀释为50～100个菌做活菌计数备用。
2.2供试液制备
各种样品浓度均为1∶10供试液，分别加入上述5种试验菌株。
2.3培养基稀释法
采用1ml供试液加三个平皿或五个平皿，每个平皿加15～20ml琼脂培养基做细菌计数，测定回收率。
2.4离心集菌薄膜过滤法
分别取不同的1∶10供试液10ml移到灭菌的离心管中，以2500～3000转/分离心3.5分钟后，取上清液1ml加入薄膜过滤器中，冲洗液300ml/膜，后取膜贴于琼脂平板，置适宜的温度培养24～72h观察结果。
3、回收率测定
3.1供试品组
取1∶10供试液加入菌液使50～100cfu/ml试验菌立即倾注琼脂培养基，平行置备两个平皿，按中国药典2000年版培养及菌落计数方法测量其菌落数。
3.2活菌组
试验中加入的活菌个数
3.3空白组
取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数
结果
1、直接接种法测定16种中成药的回收率（见表1）
表1所见，感冒清片、千柏鼻炎片、清开灵口服液、清热解毒口服液、感冒清热颗粒和板兰根颗粒6种供试品5种菌回心率试验证明无明显抑菌观察，清喉利咽颗粒、热炎宁颗粒、黄连上清丸、藿香正气滴丸、三黄片、牛黄上清片、牛黄解毒片、双黄连口服液及复方丹参片、参金黄它葡萄球菌和枯草杆菌有明显的抑菌作用，其中藿香正气滴丸还对白色念珠菌有抑菌作用，此外，三七伤药片对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌作用。
2、培养基稀释法（见表2、表3）
表2、表3所见，清喉利咽颗粒、藿香正气滴丸、三黄片、复方丹参片及牛黄解毒片的回收率依照低于70%说明稀释法尚不能彻底去除抑菌成份。
3、离心集菌薄膜过滤法（见表4）
表4所见，经离心集菌薄膜过滤藿香正气滴丸、三黄片、清喉利咽颗粒、复方丹参片和牛黄解毒片已无明显抑菌能力，回收率均超过95%，表明离心集薄膜过滤法可用于上述中成药的微生物限度检查。
结论
1、感冒清片、千柏鼻炎片、清开灵口服液、清热解毒口服液、感冒清热炎宁颗粒和板兰根颗粒6个中成药品种可用常规方法进行微生物限度检查。
2、抑菌作用弱的供试品热炎宁颗粒、黄连上清丸、牛黄上清片、三七伤药片和双黄连口服液可采用接种较大量培养基稀释至不具抑菌作用的浓度，使细菌得以正常生长。
3、藿香正气滴丸、三黄片、清喉利咽颗粒、复方丹参片、牛黄解毒片可采用离心集菌薄膜过滤法进行微生物限度检查。
参考文献
1、卫生部药典委员会 中国药典1995年版
2、卫生部药典委员会 中国药典1998年增补本
3、国家药典委员会 中国药典2000年版 北京学工业出版社 2000
4、中国药品生物制品检验所 中国药品检验标准操作规范2000年版 北京：中国医药科技出版社 2000 5、张纪忠 微生物分类学 上海：复旦大学出版社 1991
6、马绪荣、苏德模 药品微生物学检验手册 北京：科学出版社 2000
表1 16种中成药验证试验回收率及均值
药物名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉菌
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
清喉利咽颗粒 100.0 81.3 73.1 84.8 - - - 25.0 - - - 12.9 70.0 93.3 70.6 78.0 100.0 100.0 100.0 100.0
热炎宁颗粒 90.0 90.0 92.8 90.9 - - - 22.2 - - - 1.2 75.0 81.2 107.1 87.8 100.0 94.7 94.7 96.5
感冒清片 76.0 93.8 100.0 89.9 100.0 100.0 100. 100.0 76.5 85.4 87.8 83.2 70.0 81.2 107.1 79.7 100.0 100.0 84.5 94.8
黄连上清丸 100.0 71.9 73.1 81.7 - - - 4.3 - - - 0 90.0 80.0 88.2 86.1 100.0 100.0 75.0 91.7
藿香正气滴丸 72.0 87.5 69.2 76.2 - - - 0 - - - 0 - - - 10.7 100.0 100.0 75.0 91.7
干柏鼻炎片 96.0 81.3 76.9 84.7 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 98.0 94.1 100.0 100.0 100.0 100.0
1清开灵口服液 84.2 90.0 94.7 89.6 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 85.7 100.0 97.6 107.1 85.2 94.7 89.7 89.9
清热解毒口服液 89.4 100.0 100.0 96.5 80.5 78.8 100.0 87.4 88.0 100.0 100.0 100.0 137.0 93.7 100.0 100.0 100.0 126.3 121.0 121.0
三黄片 100.0 75.0 92.3 89.1 - - - 0 - - - 0 100.0 100.0 94.1 82.4 100.0 90.0 84.5 91.5
感冒清热颗粒 100.0 100.0 82.2 100.0 79.5 100.0 100.0 96.2 66.6 83.3 100.0 83.3 100.0 106.0 103.4 97.0 100.0 100.0 100.0 100.0
牛黄上清片 72.0 81.3 76.9 76.7 - - - 41.0 - - - 30.0 80.0 100.0 93.3 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
板兰根颗粒 - - - 100.0 - - - 72.7 - - - 100.0 - - - 100.0 - - - 87.5
复方丹参片 - - - 78.9 - - - 37.2 - - - 36.7 - - - 100.0 - - - 100.0
牛黄解毒片 - - - 73.7 - - - 40.7 - - - 54.4 - - - 100.0 - - - 87.5
三七伤药片 - - - 65.1 - - - 65.2 - - - 100.0 - - - 100.0 - - - 100.0
双黄连口服液 - - - 92.1 - - - 62.2 - - - 44.8 - - - 100.0 - - - 87.5
表2 培养基稀释法1 （1ml加3个平皿） 培养稀释法2（1ml 加5个平皿）
药品名称 回收率（%） 药品名称 回收率（%）
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
清喉利咽颗粒 100.0 30.0 清喉利咽颗粒 100.0 0
热炎宁颗粒 100.0 80.4
黄连上清丸 66.7 100.0 黄连上清丸 93.3 93.3
牛黄上清片 100.0 100.0
霍香正气滴丸 10.0 0 霍香正气滴丸 10.0 0
三黄片 40.0 10.0 三黄片 40.0 10.0
表3 培养基稀释法（1ml加5个平皿）
药品名称 回收率（%）
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
三七伤药片 100.0 100.0 100.0
复方丹参片 70.8 57.5 100.0
牛黄解毒片 100.0 83.1 36.0
双黄连口服液 100.0 100.0 83.3
表4 5个样品采用离心集菌薄膜过滤法结果
药品名称 回收率（%）
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
霍香正气滴丸 100.0 100.0
三黄片 100.0 100.0
清喉利咽颗粒 100.0 100.0
复方丹参片 100.0 100.0
牛黄解毒片 96.7 100.0
[日期：2006-02-23] 来源： 作者：中检所抗生素室
含抑菌成分的中成药的微生物限度检查，必须消除供试液抑菌活性后，再根据中国药典规定的方法进行检查，同时，所采用检测方法需进行验证试验，以确认供试品的抑菌活性和保证测定方法的可靠性。因此，现行中国典收载的各中成药品种检查项下，很少规定具体的微生物限度检查方法。根据国家药典会的要求，中国药品生物制品检验所抗生素室和青岛市药检所微生物室，对2005版药典拟收载的16种中成药品种微生物限度检查法进行方法验证，为规范中成药的微生物限度检查法提供科学依据。
材料和方法
1、材料
1.1仪器设备
净化工作台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃）、微波炉、康氏振荡仪、匀浆仪（300～8000r/min）、恒温水浴、电热干燥箱（250～350℃）、电冰箱、空调、高度蒸汽灭菌器、集菌仪、离心器、菌落汁数器、显微镜（1500x）、电子天平（感量0.1g）、免接触自动控制手消毒器
1.2玻璃器皿
锥形瓶（250～300ml）、平皿（9cm）、量筒（100m）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20或30ml）、注射针头、载玻片、可折卸滤器及微孔滤膜（0.45μm）均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用
1.3用具
一次性无菌衣、帽、口罩、手套、大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并定期用70%～75%，乙醇溶液浸泡）、接种环（白铱金、环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球及碘伏棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、研钵（陶瓷制、直径10～12cm）、洗手盆、实验记录纸等。
1.4试液
1.4.1消毒液
0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用），5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内供消毒带菌吸管用）75%乙醇溶液、碘酊、碘伏溶液。
1.4.2稀释剂
0.9%无菌氯化钠溶液（稀释供试液及菌液用）
1.4.3培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基、硫乙醇酸盐琼脂培养基
1.4.4染色剂
甲紫染液（Hucker液）、革兰碘液、脱色液、番红复染液
1.5样品
厂家 批号
感冒清热颗粒 南宁维威制药 630801
黄连上清丸 陕西香菊制药 030202
牛黄上清片 佐今明制药 021202
感冒清片 广东罗浮山药业 030804
热炎宁颗粒 贵阳润丰制药 030401
清开灵口服液 山西太行药业 030904
清喉利咽颗粒 山西桂龙医药 030511
千柏鼻炎片 广东博罗先锋药业 020301
藿香正气滴丸 天津天士力制药公司 030340
三黄片 山西杨文水制药厂 030222
清热解毒口服液 江西新余制药厂 030422
板兰根冲剂 四川奇力制药有限公司 030422
复方丹参片 巢湖正大药业有限公司 020401
牛黄解毒片 上海正大药业有限公司 031125
三七伤药片 上海雷允上药业有限公司 030760
双黄连口服液 上海三洋药业健康产品有限公司 0301221
购自北京和青岛两地医药商店
1.6试验菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]
大肠杆菌（Escherichia Coli）[CMCC(B)44102]
枯草杆菌（Bacillus Sulticis）[CMCC(B)63501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]
黑曲霉菌（Aspeigillus niger）[CMCC(F)98003]
来自中国医学细菌保藏中心
2、方法
2.1菌液的制备
取经37℃培养18～24h，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌肉汤培养基1ml及20～25℃培养18～24h的白色念珠菌真菌液体培养物+9ml盐水为0倍稀释，以此类推，稀释到10-4～10-7为50～100个/ml做活菌计数备用，取经20℃～25℃培养一周的黑曲霉斜面培养物、加水3～5ml，洗下霉菌孢子，用带有棉花的球形吸管取出菌液，用标准比浊管比浊后，稀释为50～100个菌做活菌计数备用。
2.2供试液制备
各种样品浓度均为1∶10供试液，分别加入上述5种试验菌株。
2.3培养基稀释法
采用1ml供试液加三个平皿或五个平皿，每个平皿加15～20ml琼脂培养基做细菌计数，测定回收率。
2.4离心集菌薄膜过滤法
分别取不同的1∶10供试液10ml移到灭菌的离心管中，以2500～3000转/分离心3.5分钟后，取上清液1ml加入薄膜过滤器中，冲洗液300ml/膜，后取膜贴于琼脂平板，置适宜的温度培养24～72h观察结果。
3、回收率测定
3.1供试品组
取1∶10供试液加入菌液使50～100cfu/ml试验菌立即倾注琼脂培养基，平行置备两个平皿，按中国药典2000年版培养及菌落计数方法测量其菌落数。
3.2活菌组
试验中加入的活菌个数
3.3空白组
取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数
结果
1、直接接种法测定16种中成药的回收率（见表1）
表1所见，感冒清片、千柏鼻炎片、清开灵口服液、清热解毒口服液、感冒清热颗粒和板兰根颗粒6种供试品5种菌回心率试验证明无明显抑菌观察，清喉利咽颗粒、热炎宁颗粒、黄连上清丸、藿香正气滴丸、三黄片、牛黄上清片、牛黄解毒片、双黄连口服液及复方丹参片、参金黄它葡萄球菌和枯草杆菌有明显的抑菌作用，其中藿香正气滴丸还对白色念珠菌有抑菌作用，此外，三七伤药片对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌作用。
2、培养基稀释法（见表2、表3）
表2、表3所见，清喉利咽颗粒、藿香正气滴丸、三黄片、复方丹参片及牛黄解毒片的回收率依照低于70%说明稀释法尚不能彻底去除抑菌成份。
3、离心集菌薄膜过滤法（见表4）
表4所见，经离心集菌薄膜过滤藿香正气滴丸、三黄片、清喉利咽颗粒、复方丹参片和牛黄解毒片已无明显抑菌能力，回收率均超过95%，表明离心集薄膜过滤法可用于上述中成药的微生物限度检查。
结论
1、感冒清片、千柏鼻炎片、清开灵口服液、清热解毒口服液、感冒清热炎宁颗粒和板兰根颗粒6个中成药品种可用常规方法进行微生物限度检查。
2、抑菌作用弱的供试品热炎宁颗粒、黄连上清丸、牛黄上清片、三七伤药片和双黄连口服液可采用接种较大量培养基稀释至不具抑菌作用的浓度，使细菌得以正常生长。
3、藿香正气滴丸、三黄片、清喉利咽颗粒、复方丹参片、牛黄解毒片可采用离心集菌薄膜过滤法进行微生物限度检查。
参考文献
1、卫生部药典委员会 中国药典1995年版
2、卫生部药典委员会 中国药典1998年增补本
3、国家药典委员会 中国药典2000年版 北京学工业出版社 2000
4、中国药品生物制品检验所 中国药品检验标准操作规范2000年版 北京：中国医药科技出版社 2000 5、张纪忠 微生物分类学 上海：复旦大学出版社 1991
6、马绪荣、苏德模 药品微生物学检验手册 北京：科学出版社 2000
表1 16种中成药验证试验回收率及均值
药物名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉菌
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
清喉利咽颗粒 100.0 81.3 73.1 84.8 - - - 25.0 - - - 12.9 70.0 93.3 70.6 78.0 100.0 100.0 100.0 100.0
热炎宁颗粒 90.0 90.0 92.8 90.9 - - - 22.2 - - - 1.2 75.0 81.2 107.1 87.8 100.0 94.7 94.7 96.5
感冒清片 76.0 93.8 100.0 89.9 100.0 100.0 100. 100.0 76.5 85.4 87.8 83.2 70.0 81.2 107.1 79.7 100.0 100.0 84.5 94.8
黄连上清丸 100.0 71.9 73.1 81.7 - - - 4.3 - - - 0 90.0 80.0 88.2 86.1 100.0 100.0 75.0 91.7
藿香正气滴丸 72.0 87.5 69.2 76.2 - - - 0 - - - 0 - - - 10.7 100.0 100.0 75.0 91.7
干柏鼻炎片 96.0 81.3 76.9 84.7 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 98.0 94.1 100.0 100.0 100.0 100.0
1清开灵口服液 84.2 90.0 94.7 89.6 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 85.7 100.0 97.6 107.1 85.2 94.7 89.7 89.9
清热解毒口服液 89.4 100.0 100.0 96.5 80.5 78.8 100.0 87.4 88.0 100.0 100.0 100.0 137.0 93.7 100.0 100.0 100.0 126.3 121.0 121.0
三黄片 100.0 75.0 92.3 89.1 - - - 0 - - - 0 100.0 100.0 94.1 82.4 100.0 90.0 84.5 91.5
感冒清热颗粒 100.0 100.0 82.2 100.0 79.5 100.0 100.0 96.2 66.6 83.3 100.0 83.3 100.0 106.0 103.4 97.0 100.0 100.0 100.0 100.0
牛黄上清片 72.0 81.3 76.9 76.7 - - - 41.0 - - - 30.0 80.0 100.0 93.3 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
板兰根颗粒 - - - 100.0 - - - 72.7 - - - 100.0 - - - 100.0 - - - 87.5
复方丹参片 - - - 78.9 - - - 37.2 - - - 36.7 - - - 100.0 - - - 100.0
牛黄解毒片 - - - 73.7 - - - 40.7 - - - 54.4 - - - 100.0 - - - 87.5
三七伤药片 - - - 65.1 - - - 65.2 - - - 100.0 - - - 100.0 - - - 100.0
双黄连口服液 - - - 92.1 - - - 62.2 - - - 44.8 - - - 100.0 - - - 87.5
表2 培养基稀释法1 （1ml加3个平皿） 培养稀释法2（1ml 加5个平皿）
药品名称 回收率（%） 药品名称 回收率（%）
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
清喉利咽颗粒 100.0 30.0 清喉利咽颗粒 100.0 0
热炎宁颗粒 100.0 80.4
黄连上清丸 66.7 100.0 黄连上清丸 93.3 93.3
牛黄上清片 100.0 100.0
霍香正气滴丸 10.0 0 霍香正气滴丸 10.0 0
三黄片 40.0 10.0 三黄片 40.0 10.0
表3 培养基稀释法（1ml加5个平皿）
药品名称 回收率（%）
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
三七伤药片 100.0 100.0 100.0
复方丹参片 70.8 57.5 100.0
牛黄解毒片 100.0 83.1 36.0
双黄连口服液 100.0 100.0 83.3
表4 5个样品采用离心集菌薄膜过滤法结果
药品名称 回收率（%）
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
霍香正气滴丸 100.0 100.0
三黄片 100.0 100.0
清喉利咽颗粒 100.0 100.0
复方丹参片 100.0 100.0
牛黄解毒片 96.7 100.0
