WB实验中，曝光后的PVDF膜如何正确保存？

WB实验中，PVDF膜如何选择？怎样活化？转膜后怎么保存？等等操作，小伙伴都清楚不？今天跟小编一起了解下吧。

选膜：

选择合适的膜是关键之一。不同的膜具有不同的特点，需要根据实验的具体需求进行选择。转移分子量小于20kDa的蛋白时建议使用小孔径的膜 (如0.22μm)，正常情况下使用0.45μm孔径的膜即可。

PVDF膜浸泡步骤？

湿转：

(1) 将膜在甲醇中浸泡30秒。膜应均匀的从不透明变成半透明。

(2) 小心的将膜放入双蒸水中，浸泡2分钟。

(3) 小心的将膜放入转印缓冲液中，至少平衡5分钟。

半干转：

第一步甲醇浸泡只需15秒，其他步骤同上。

怎样确定PVDF膜的转膜是否成功？

染色法：这是一种常用的方法来评估PVDF膜上的蛋白质转移情况。通过染色，可以直观地观察到蛋白质在膜上的分布。

染料分类：PVDF膜染料主要分为两大类，即可逆染料和不可逆染料。

可逆染料：例如丽春红，它们的优点在于可以在评估印迹后从膜上洗掉，不会干扰后续的免疫检测或其他分析。但它们的灵敏度通常不如不可逆染料。

不可逆染料：如氨基黑和考马斯亮蓝，虽然灵敏度高，但一旦染色，会永久性地标记蛋白质，从而干扰后续的进一步分析。

如何剥离PVDF膜上的抗体？

立即剥离：如果可能，应在第一次使用后立即进行抗体剥离。

保存膜：如果无法立即剥离，需将PVDF膜用保鲜膜包裹，并存放在含有PBS的密封袋中，然后置于4°C保存。避免膜干燥，因为这可能会影响后续的剥离效果。

准备剥离溶液：使用加热和去污剂的组合来帮助从PVDF膜上剥离抗体。例如，可以使用含有脱脂剂的溶液，如0.1 M 甘氨酸（pH 2.2）或0.1 M 盐酸。

加热剥离：将PVDF膜浸入剥离溶液中，然后加热至约37°C至55°C，以促进抗体的解离。

温和摇动：在加热过程中，轻轻摇动膜，以帮助去除抗体，通常需要几分钟到几十分钟不等。

监测剥离效果：定期检查膜，以确认抗体是否已成功剥离。

中和pH：剥离后，使用1×PBS或1×TBS缓冲液将膜中和至中性pH，以准备膜的再次使用。

清洗和保存：彻底清洗膜以去除所有残留的剥离溶液，然后根据需要保存或立即进行下一步实验。

WB曝光后PVDF膜如何保存？

洗涤膜：

如果膜上存在未结合的检测试剂，首先使用TBST或PBST溶液进行洗涤，通常需要洗涤多次以确保清除。

干燥膜：

洗涤完成后，让膜在室温下自然干燥。PVDF膜干燥后结构稳定，干燥状态便于保存，且可以重新湿润以进行后续实验。

保护膜：

干燥后，将膜夹在保护膜或透明塑料袋中，确保膜平整无折痕或损伤。

低温保存：

短期保存时，将膜存放在4°C的冰箱中。

4°C 最多2周；-20°C 最多2个月；-80°C 长期保存。，但需注意长期低温可能会影响某些蛋白质的抗原性。

避光保存：

如果膜上有荧光标记或对光敏感的物质，应在黑暗中保存，避免光照导致信号衰减。

记录信息：

在膜或其包装上记录重要信息，例如实验日期、膜上内容等，以方便未来的查询和使用。

若需重新使用该膜进行曝光，遵循以下步骤：

缓慢解冻：

从-80°C冰箱取出PVDF膜后，在4°C冰箱中缓慢解冻数小时，或在室温下解冻至少30分钟到1小时，以防止因温差过大而损伤膜结构。

缓冲液平衡：

将膜在TBST或PBST中平衡一段时间，这一步有助于去除储存过程中可能形成的结晶或沉淀。