bioluminescence immunoassay生物发光免疫测定
概述
生物发光技术的硏究近年来得到了迅速发展,由于生物发光具有非放射非创伤损害性高灵敏度等优势,因此生物发光检测技术在生物医学领域得到了广泛的应用,尤其在生物医学研究、临床诊断等方面应用越来越广泛,已经成为现代生物技术的一个组成部分。特别是发光免疫分析技术及荧光素酶报告基因的应用已逐步形成一个产业。
生物发光技术原理
生物发光技术机理所谓生物发光,就是生物体内的发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象。其特点是只消耗能量物质,不消耗发光物质。生物发光属于冷光范畴,即发光不是由于发光体温度升高所致,发射波长也于其温度无关。目前被发现的生物发光底物有虫荧光紊、腔肠素、虾素等。事实上,许多物质既是生物发光底物,同时也是化学发光底物,因此生物发光和化学发光在分子和量子机理方面存在着许多相似性。人类模拟自然界生物发光底物的某些结构,已经合成了多个高效化学发光底物,其发光波长几乎覆盖了所有的可见光区域,量子效率也达到了空前水平。
生物发光技术的应用
2.1微生物快速检测
腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)是维持细胞存活的基本物质,因此利用虫荧光素酶发光测定样品中的活细菌细胞内的ATP由于活细菌细胞内的ATP含量相对稳定,因此很容易以此计算出标本中的细菌数。虫荧光素酶发光系统是在生物学中应用最成功的典范,其最具价值的应用是细菌总数(TBC)和可同化有机碳(AOC）的快速测定,目前该技术已经用于环境和卫生检测。用该方法进行临床标本细菌总数的快速测定时,与传统的培养方法具有很好的相关性,却可在一个小时内完成病原体的鉴定和药敏实验。
2.2生物传感器
所谓生物传感器,就是通过非创伤的办法,连续、实时、动态地检测生物体内的某一种或某几种物质浓度的技术。目前,利用生物发光和化学发光的生物传感器已经成为生物传感器领域内的主力军。一般常见的有三种类型:一是将酶等固化到载体上,通过其与样品中的待测物反应产生光信号或使光信号发生改变;二是利用免疫学原理将抗体或抗原固化到载体上,通过其与待测物的特异结合引发光信号;三是利用类似报告基因的原理,将荧光素酶基因与特定启动子重组,并导入细菌,从而培育出可被特定物质诱导表达荧光酶素,并产生生物发光的微生物,称为微生物传感器。第一类传感器主要用于环境或食品中有机磷残留的检测,其灵敏度可达20ng/ml;另一种由苯丙氨酸脱氢酶、荧光素酶等组合构成的生物传感器,用于遗传性苯丙酮尿症病人自我检测尿中的苯丙氨酸,其检测限为1umol/l,完全满足临床要求。第二类是利用免疫反应的生物传感器,用于测定人微球蛋白等,经过进一步改进的方法可将多种半抗原固化到微玻璃片的不同部位,制造出所谓的“生物芯片”,它可与同一样品中的多种待测物同时反应,实现“并行处理”即多种待测物的连续、同时确认及定量。
2.3分子生物学技术
荧光酶素基因作为报告基因用于分子生物学研究,以及用发光物质或酶为标记并以化学发光或生物发光检测分子杂交信号,已经成为两项被广泛应用的成熟技术。特别是用荧光酶素基因重组技术培育可发光的转基因动物、肿瘤细胞、致病菌等;并通过连续检测动物活体的发光强度,在活体水平动态观察疾病的发生、发展的过程。这一技术构建的疾病动物模型必将为医学发展开辟全新的领域。发光蛋白作为一种非放射性、高灵敏度的标记物,近年来也被用于免疫及基因标记分析中。例如利用水母素或虫荧光素酶标记抗原、抗体,然后进行特异性抗原、抗体的检测与分析。
