blastocyst injection胚泡注射

概述

在哺乳动物的受精卵发育到囊胚分化为两种明显不同的组织一内细胞团(ICM)和滋养层细胞以后,将目的细胞或细胞团注人到囊胚腔,使注人细胞与內细胞团结合共冋发育,以获得嵌合体。

原理

胚胎干细胞是在胚胎植入子宫前,从囊胚状态的胚胎的内细胞团分离出来的一群多能干细胞,理论上可分化为任意的体细胞。基因打靶技术即建立在ES细胞与DNA同源重组等技术基础上的分子生物学技术。利用同源重组技术对ES细胞特定位点的基因进行改造,通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性,可以发育为嵌合体动物的生殖细胞,使得修饰的遗传信息经生殖系遗传。尤其是近几年 CRISPR/Cas9掀起的基因编辑浪潮,极大地催化了ES细胞基因打靶技术的步伐,丰富了科研人员对人类疾病和相关基因功能的了解。

ES细胞打靶的实验步骤

1.ES细胞扩增至合适密度,消化并进行细胞计数。为提高电转效率,用1 x DPBS重悬细胞沉淀;

2.细胞计数后取5x106细胞悬液至灭菌1.5mlEP管中,并加入 sgRNA(10μg)和Cas9(10μg)表达质粒、 Donor质粒(15μg),混合均匀,并将体积用1 XDPBS补至80oμ,后将液体转移至洁净电转杯(Bio-Rad,4mm)中;

3.电转仪进行电转,电转后向电转桥中加500μl预热ESmedium,用枪轻轻吹匀并小心吸出液体,加入预先准备ESmedium的10cm皿中,摇匀培养

4.24h后吸出旧的培养基,1 XDPBS清洗细胞碎片,后加入8ml新鲜ES培养急基;

5.48h后加 puromycin(浓度为1.2-3.0μg/ml)进行筛选

6.每天换液,约筛选6天开始挑取单克隆至48孔板中;7.待7-9天克隆长起来后将其分别传代至24孔板中扩大培养;

8.约2-3天克隆成功扩增后每个孔取3/4细胞进行基因型鉴定,1/4细胞继续传代培养;

9.基因型鉴定完成后,即可根据细胞培养状态安排胚胎囊胚注射实验,并将注射后的胚胎移植到假孕母鼠体内;

10.待小鼠出生后鉴定子代嵌合体( chimera)形成情况,并通过子代嵌合体小鼠的交配繁殖获得能稳定遗传的小鼠。

胚胎干细胞的胚泡注射法构建Cre转基因动物

先将Cre时空特异表达载体线性化,之后用电穿孔等方法将其导人胚胎干细胞中,并以同源重组的方式整合进胚胎干细胞的基因组。这种经过遗传改造的胚胎干细胞再被注入胚泡,最后将胚胎植入假孕母鼠的子宫,使其发育成为一个个体。胚泡注射法的具体步骤如下:(1)选择合适的载体,将Cre重组酶的编码基因与其重组,构建重组质粒;(2)重组质粒线性化后,用电穿孔、脂质体等方法将其转人体外培养的小鼠胚胎干细胞中;(3)体外筛选稳定整合外源基因的胚胎千细胞;(4)筛选出的胚胎干细胞被重新注射到小鼠胚泡中,并植入到假孕小鼠的子宫内,使其重新发育为一个完整的胚胎;(5)产出的嵌合体小鼠通过杂交,最终获得稳定整合Cre重组酶的纯合体转基因小鼠。

釆用雄性原核显微注射法时,Cre表达基因是随机的整合到基因组中去的,因此其表达的时空特异性和表达水平除了受启动子的影响外,还会受到整合位点的影响,因此需要同时生产多个转基因鼠家系,以便从中选出符合要求的转基因鼠。釆用这种方法时选择合适的启动子就显得尤为重要。该方法的优点是操作过程比较省时省力。

另外一种构建Cre转基因小鼠的方法是采用同源重组,使Cre基因置于内源性启动子的控制之下。这个策略可以实现Cre基因表达的最佳化,因为这时所有的基因表达调控元件均处于天然位置,可以避免常规转基因小鼠通常出现的异位表达问题。此外,采用这种方法只要获得靶基因的同源序列就可以进行,没有必要再去详细研究其启动子。但是该方法的缺点是操作过程费时费力。因此,当有合适的启动子可供选择时,多数硏究者宁愿使用雄性原核显微注射法生产Cre转基因小鼠。