Radial Immuno-diffusion(RID)环状免疫扩散法

概述

环状免疫扩散法因操作方法简单,广泛应用于测定体液中Ig含量,血痕检材等方面。

环状免疫扩散免疫球蛋白测的实验方法

1.材料:抗IgG、抗IgA、抗IgM诊断血清及Ig参考血清,琼脂粉

2.方法:用已融化并冷却至56℃的1.2%琼脂液稀释抗Ig血清,制成厚为1.5毫米的含杭Ig单价免疫血清琼脂板,用内径3.0毫米的打孔器打孔,孔距12-15毫米,每孔加入一定稀释度的待检血清10微升,加样后将琼脂板放湿盒內,密闭,置37℃恒温箱中,IgG扩散24小时,IgA及坛M扩散48小时,取出,测量白色沉淀环直径(亳米),查标准曲线,乘以血清稀释倍数,求得Ig含量。

标准曲线绘制:按说明书规定,稀释Ig参考血清,将不同稀释度的Ig参考血清分别加于相应的含抗Ig单价免疫血清琼脂板的小孔中,每孔10微升,按上述方法扩散,测量白色沉淀环直径(亳米)。以沉淀环直径为横座标,以馆含量为纵座标,在对数纸上作图,绘制标准曲线。

影响因素

1.当抗IgM血清稀释度为1:100时,形成的沉淀环清晰,沉淀环直径与浓度的对数成正比。抗体浓度再增高,形成的沉淀环较小但很清晰,降低抗休浓度,形成的沉淀环较大但不清晰,当抗体浓度过高或过低时,则沉淀环的直径与浓度的对数不成正比关系。应当选用抗体稀释度高、形成的沉淀环边缘清晰、沉淀环直径与浓度的对数成正比,又能检出体液中正常范围Ig值及最大限度的异常Ig值的那样种稀释度。

2.购来的抗Ig血清,说明书上虽已注明抗体血清稀释度,但因在保存及运输过程中,抗Ig血清的效价可能下降,故应经常校正标准曲线。尤其是更换不同产地或不同批号更应重新绘制标准曲线,与原标准曲线对照。如前后结果相差显著,则应重新调整抗Ig血清实验的稀释度,以保证前后结果一致。应用单向环状免疫扩散试验测定体液中Ig含量的影响因素很多。在有标准化Ig参考血清的前提下,最重要的是琼脂板中抗Ig血清和抗原的浓度,以及二者的比例。抗体浓度高时,形成的沉淀环直径小较低浓度的杭原可能不形成沉淀环,抗体浓度低时,形成的沉淀环较大较高浓度的抗原可能不形成沉淀环。只有抗体和抗原的浓度和比例适当,才能形成清晰的沉淀环,且其直径和挑原浓度的对数成正比。其次是琼脂的质量和琼脂板的厚度,琼脂板厚时所形成的沉淀环直径较小,薄时形成的沉淀环直径较大,应固定厚度,以1.5-2.0毫米为好。第三是扩散时间及温度,37℃时较22℃扩散快。在一定时间內沉淀环直径随扩散时间的延长而增大。一般情况下,37℃扩散24小时(IgG)至45小时(IgA及IgM)即可。

环状免疫扩散在洗涤剂污染血痕检材中的应用

在血痕种属检验中,通常采用较为灵敏和快速的环状沉锭法。当遇有被肥皂、洗衣粉等污染的血痕检材时则往往得不到正确结果。釆用琼脂单向免疫扩散法对常见洗涤剂污染的血痕检材进行实验,取得了满意的结果。使用(1)人血样品。(2)抗人血红蛋白血清(效价:1:10000。(3)琼脂糖,1.5%和5%的肥皂液,1.5%和5%伪洗衣粉液,1.5%和5%的餐具洗洁精液(以上液体均用自来水配制而成)。(4)加热磁性搅拌器、冰箱、培养皿。用环状免疫扩散鉴定微量血痕种属,实抗原在混有抗体的琼脂糖凝胶中溶解扩散,与周围的抗体结合,形成肉眼可见的环形。