SiRNA设计入门
RNAi(RNA interference)是由双链RNA诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象。使用siRNA进行基因沉默因实验操作方便，深受广大科研工作者青睐，也成为了分子生物学应用中最常用的基因下调工具。
设计siRNA的第一步就是选择siRNA靶点，关于靶点设计的注意事项，如：同源区设计、blast比对等。
SiRNA设计原则
1.选择靶点序列
- 序列特点：19~21个碱基
- GC含量适中：35%-55%
- 避免出现超过4个连续的A或T
- 尽量设计在CDS区
- 序列位置分布均匀
2.分析靶点特异性
- 默认针对同源区设计
- 与非目的基因连续匹配的碱基数不超过15bp
RNAi作用机制
SiRNA设计方法
1.NCBI
从NCBI获取关键信息：Gene ID、Genbank ID、转录本之间的同源性。
在NCBI主页GENE界面输入“基因名称”、“物种”，搜索对应的基因。
基因界面显示多重信息：
下拉至“Genomic regions, transcripts, and products”，可以看到转录本信息Genbank ID（共计15个转录本），此ID与序列对应，可在核酸界面查询序列，Genbank ID命名规则如下：
- NM,XM--编码类型转录本（NM为认证的，XM属于预测的）；
- NC,NG,AC等—基因组类型；
- NR,XR—非编码转录本（NR表示认证的，XR表示预测的）；
- AK、AF等命名—看注释，大部分为文章的作者提交的序列。
Genbank ID对应的横线表示前体RNA
竖形方块表示外显子
浅色方块表示UTR
深色方块表示编码区
每个Genbank ID共有的方块即为同源区
选择转录较短及同源外显子最多的转录本设计靶点，位于同源区概率较大（如TP53基因NM_001276697和NM_001126115，此两个转录本只是一号外显子部分序列为非同源区）。
2.Invitrogen RNAi Designer设计
打开Invitrogen网站，选择“siRNA”，step1输入Genbank ID或者核酸序列，step2默认编码区；step3选择No Blast；step4 GC含量默认；step5位设计原则，默认即可，点击“RNAi Design”。
以设计NM_001276697为例，网站默认给出十个靶点及对应信息， Rank星星较多的靶点为高分值，Tuschl's pattern也是靶点评分方法，以A>B>C>D的评分排序。选择靶点可以综合参考这两项。
3.GE Dharmacon
GE Dharmacon为专业提供siRNA服务的公司，其设计网站具有一键同源区设计的功能，流程如下：
打开Dharmacon网站，步骤一有三种信息可填，分别为核酸序列（序列以fasta格式输入，为大于号命名，另起一行填序列）、Gene ID、Genbank ID。
步骤1：选择一个识别符类型
以TP53的Gene ID为例，输入7157，获取NCBI的转录本信息，同源区设计通过三个参数的调整（取部分截图）：
“必填”为靶点靶向对应转录本（如果都选必填，那么就是针对同源区）
“准许”为可以靶向也可以不靶向对应转录本
“排除”为靶点不靶向对应转录本（可满足针对不同转录本设计特异性靶点的需求）
步骤2-4参数同Invitrogen，根据需求选择：
点击“设计siRNA”。评分从高到低，根据Accession的Genbank ID查找对应位置的序列（网站设计默认19bp的靶点），序列快速查找方式见视频snapgene快速导出核酸信息。
4.BLAST比对
每个设计网站blast使用的底层数据库有差别（NCBI数据一直在更新，不同时段有不同的数据版本，网站blast数据库不一定实时更新），导致blast结果不一。因此在设计时我们舍弃网站本身blast选项，直接以NBCI-blast比对靶点。打开BLAST网站：
填入核酸序列，选择比对数据库点击“blast”。人、小鼠有快速选项，若为其他物种，则点击“others”，“nr/nt”默认，物种输入指定的即可，下方给出三大物种指令：
Norway rat (taxid:10116)
house mouse (taxid:10090)
Homo sapiens (taxid:9606)
结果界面，Max Score列数值除以2表示匹配的碱基数；完全匹配的全部都是TP53基因的15个转录本，所以，靶点位于同源区；其次，非完全靶向的Max Score最大值为30.2，也就是跟基因SIPA1L2实际结合15个碱基，错配四个，符合特异性原则，该靶点blast结果OK。
以上即靶点设计及比对的流程，该方法同样适合非编码RNA，选择多个网站设计的共有靶点以及设计2~3个靶点进行验证，更加有利于筛选出有效靶点。
