小鼠脾脏Th1/Th17细胞检测标准流程

1.1 脾脏准备

脾脏取出后泡在PBS中置于4℃保存。

1.2 实验对照及panel设置（此panel只在第一次做实验时才使用，主要用于调整补偿以及辅助设门等）

1.3 实验方法

以下步骤在超净工作台中完成，进入超净工作台的所有物品均需先用酒精擦拭。

准备工作：

Ø 将实验用所需耗材（如移液器、离心管、巴氏管、24孔板、Tip头等）放入超净台，灭菌30min后待用；

Ø 将淋巴细胞分离液、生理盐水、1640培养基、刺激剂、胎牛血清从冰箱中取出平衡至室温（如将此类耗材放入超净工作台不得开启紫外灭菌模式）；

Ø 采用尼龙膜磨碎脾脏，200目细胞过滤器过滤后采集细胞悬液，500g离心弃上清。

红细胞裂解：

Ø 采用纯水稀释Lysing Solution 10× Concentrate 成1×溶血素工作液；

Ø 每管加入1ml 1×溶血素工作液，涡旋混匀后静置10~15min；500g离心5min，弃上清；

Ø 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基完全培养基重悬细胞沉淀，用细胞计数板计数；

Ø 配置完全培养基（每个样本至少准备1ml培养基）。以50ml培养基为例，45ml 1640培养基+5ml 10%FBS+100µL Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug。

Ø 用完全培养基稀释细胞密度到1×10⁷cells/mL。

Ø 取1mL细胞悬液到24孔板中，做好标记，然后将培养板放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱培养6-8h（不少于6h）；

Ø 从细胞培养箱中取出细胞培养板并收集体外刺激培养的细胞，350g离心5min后弃上清；

以下步骤可在有菌环境中操作，不影响实验效果。

死活标记：

Ø 在Fixable Viability Stain 510中加入260µL DMSO，然后按1:1000的比例加入到细胞悬液中，室温避光孵育15min，加入2ml BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS)，500g离心5min 弃上清。

抗体标记：

Ø 准备流式上样管，并做好相应的标记。

Ø 用3~5mL PBS重悬细胞，350g离心5min后弃上清，重复2~3遍，然后采用100μL的BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS)重悬细胞。

Ø 按照管设置分别加入相应的表面标记抗体（先按照样本数量对表面抗体进行预混，然后按量加，如本方案中的Ms CD45 APC-Cy7 30-F11、PE-Cy™7 Hamster Anti-Mouse CD3e、FITC Rat Anti-Mouse CD4），混匀后，室温避光孵育15-20min。

Ø 加入至少2mL的PBS洗1次，350g离心，5 min，弃上清。

Ø 加入100μL MEDIUM A，室温孵育15min。

Ø 加入3ml流式染色缓冲液，300~350×g离心5min，弃上清，涡旋振荡，使残留的液体重悬细胞沉淀；

Ø 加入100ul MEDIUM B和推荐体积的胞内抗体/同型对照（即本方案中的Ms IFN-Gma PerCP-Cy5.5 XMG1.2、Ms IL-17A BV421 TC11-18H10）。

Ø 涡旋振荡1~2s，室温避光孵育30min，

Ø 加入1ml染色缓冲液，300~350×g离心5min，弃上清。

加入0.5ml流式染色缓冲液，上机检测。