如何设计国自然热点circRNA研究路线

1）国自然热点

    国自然课题热点中 circRNA、LincRNA、circRNA、ceRNA项目呈逐年增长趋势

（2）了解circRNA的研究技术路线

前期实验设计思路：先讲miRNA→再讲mRNA→最后circRNA→细胞模型+大鼠模型→IVDD

Step1：选择细胞模型和动物模型

发现临床问题后，确定细胞和动物模型，在细胞、动物模型中来建立临床问题和科学假说的直接联系。
    可以取组织或者器官最丰富或者最重要的细胞系或者原代细胞，进行传代培养

Step 2：先从哪个分子着手呢？miRNA！

先从miRNA入手吧，上可找circ，下可寻mRNA。

呵呵，没钱测序？GEO里有啊

那接下来就是一顿围绕miRNA的操作了：

Q-PCR、Northern blot：在病人的组织样本中验证一下表达量；

细胞相关实验:

Step 3：mRNA！

 可以选择先讲下游的调控机制：miRNA的下游靶基因

上面说到，正常细胞转染mimics后出现了凋亡。

使用miRNA靶基因预测神器：Starbase

①预测的基因→DAVID的GO和KEGG→凋亡信号通路相关的mRNA若干→凋亡基因

②miRNA调控靶基因mRNA的表达验证：

荧光素酶报告实验：结合位点突变验证miRNA同mRNA靶向互作

细胞实验：

Step 4：CircRNA！

 怎么预测miRNA的上游circRNA呢？还是神器starbase！

又是一顿互作的操作和表型检测

①证明该circRNA确实存在，且和其他转录本区分开：PCR、样本验证、FISH定位

②cricRNA的敲减和过表达：miRNA、mRNA的表达量以及细胞凋亡检测

③证明该circRNA和miRNA互作：CLIP sequence、RIP、pulldown、FISH定位

CLIP测序:检测circRNA中有几个miRNA的结合位点！

RIP实验：评估circRNA和miRNA互作深度：

Step 5：大鼠体内验证circRNA的功能

构建动物模型，病理切片

好了，以上就是circRNA研究路线和涉及的实验方法！

Step 6：最后不要忘记假说机制图啊！