Edu细胞增殖检测原理及实验步骤
Edu细胞增殖检测
直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一，是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法，其中以前常用的方式是利用胸腺嘧啶核苷酸类似物----BrdU进行检测。因为在细胞周期的S期，和细胞一起孵育的BrdU能渗入DNA分子中，再结合BrdU抗体与渗入DNA的BrdU特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞。
但BrdU有一大缺点，就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。哈佛大学医学院细胞生物学家Adrian Salic就认为：“为了能够暴露BrdU的抗原表位，必须用高浓度的盐酸，乙酸或酶解，但经历了如此严重的处理后，细胞原本精巧细致的结构在显微镜下就变得惨不忍睹了。”
事实上，现在有一种新的检测方法能避免这种情况的发生----EdU检测。
EdU可以在DNA复制的时候掺入到新合成的DNA链中,通过一个“Click”反应,把荧光基团标记到新合成的含有EdU的DNA上面,这样我们就能通过检测荧光而知道细胞的增殖情况了。
操作步骤
1. 细胞培养：取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段
2. 药物处理：根据实验需要进行各种药物处理
3. EdU标记：用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；
注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2h)宜采用高浓度(10~50 μM)，长时间孵育(>24h)宜采用低浓度 (1~10μM)；
a.如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；
b.配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。
4. 细胞固定
5. Apollo染色
6. 图像获取及分析
客户提供
1.提供新鲜的肝素或者EDTA抗凝的外周血；
2.提供新鲜的培养细胞，提供新鲜组织，需要实验室制备成单细胞悬液。
