仍是关于人外周血测流式Th17的问题

本人菜鸟一枚，真心求助，做了好几个样本了，实验组，对照组几乎没什么区别，几乎全部出Th17细胞。还请高人指点。

所用抗体及试剂：抗体CD3-APC， CD8-Fitc,  IL-17a-PE,抗体都是BD的。PMA/lonomycin, Monensin/BFA（联科生物）, FIX&PERM AB液（联科生物），staining buffer (联科生物)。

操作：1，取外周血125ul+125ul1640(不含小牛血清-FBS)，加1ulBFA 和PMA（都是将BFA 和PMA加到1640中混匀，再加入到取好的外周血中），37度，5%CO2培养6小时。

          2，取100ul刺激好的全血，加CD3,CD8抗体各15ul,4度 避光 30分钟

          3，加FIX&PERM A液 100ul室温避光15分钟

          4，加3ml staining buffer, 300g 离心5min, 弃上清，收集细胞。

          5，加FIX&PERM B液 100ul，加 IL-17抗体 17ul,室温避光 20min.

          6,加入3ml staining buffer, 300g离心5min,弃上清，收集细胞

          7，PBS重悬，上机。

问题：几乎没有圈到Th17细胞。

现在我怀疑是以下环节出了问题，请大家帮我分析分析：

1.抗凝血应该选择肝素钠，但是我做的临床样本，肝素钠标本不好收集，都选的是EDTA抗凝血，血液标本都是抽好，最迟的30小时内做实验，存放的时候是常温存放，竖着放的。

2，怀疑是不是刺激剂失效了？

3，是不是BFA的阻断作用太强了？（我觉得这点不太可能，毕竟就加那么少）

4，刺激时间的问题？

5，最后上机重悬，没有用staining buffer用的是PBS缓冲液，

6,操作过程中得开着灯，没办法。但中间孵育一直避光，是不是上机前几分钟有曝光的原因（我觉得这点不太可能）

另外，我们实验室流式机子就周一，周三，周四，上午8点半到11点半开机，我都是从半夜12点开始刺激，早上5点又奔赴实验室做后续步骤，而且临床标本不知道是只收集前一天的，还是前几天都可以，保存有没有特殊要求还真的不知道，希望可以得到高手的帮助，试剂这么贵，人力物力财力经历，实在是耗不起呀。。

我说了这么多，大家也多说点吧。