【求助】CFSE染色求助

求助CFSE染色，我用的是8w左右C57小鼠脾脏，经过磁珠阴性分选，得到全T细胞，然后在CD3预孵的96孔板上养3d，始终是看到细胞变大变圆，CFSE却只有一个峰，求助，真的是好几个月了，老板给的经费快耗光了， 明年毕业估计也没戏了，再做下去人生都无望了……
我的详细步骤如下：
1.小鼠脱臼处死，浸酒精，取脾，放入预冷的1640中带回实验室。
2.200目滤网加5ml注射器芯研磨，每研磨几下用D-Hanks冲洗一次，直到滤网上只剩白膜。
3.1500转5min离心，弃上清，用ebioscience的红细胞裂解液1ml 轻轻吹打均匀，裂解 1min后加7mlPBS终止。
4.1500转5min离心，弃上清，加美天妮的分选buffer洗涤一次，离心弃上清。
5.按照美天妮磁珠分选流程（加抗体／加磁珠／过柱……这一步应该是没问题的，因为我用磁珠分选可以达到98%的纯度）。
6.invitrogen的CFSE染色：将18ulDMSO加入一小管CFSE中，得到5mM的CFSE。将1ulCFSE溶于2mlPBS中，得到2.5uM的CFSE工作液，将T细胞离心后加PBS制备成0.5ml的细胞悬液，与0.5mlCFSE工作液迅速混合均匀。（即染色浓度为1.25uM）。将T细胞悬液放置于37度水浴中10min，每2min轻摇一次。（invitrogen说明书中说要不含蛋白的PBS染色，所以我没有加BSA或者FBS。）
7.细胞悬液加5ml完全培养基，离心弃上清，再加5ml完全培养基，离心弃上清。（就是用5倍体积完全培养基洗2次）（有的说要用预冷的培养基，有的说要放置一会儿再离心，我是室温培养基直接离心可以吗？）
8.细胞沉淀确实能看出黄色来，染完立即做流式也有一个大峰，应该是染上了。
9.细胞在完全培养基中吹打成单细胞悬液（Gibco的1640培养基＋10%Gibco胎牛血清＋1%双抗＋0.1%二巯基乙醇＋1%丙酮酸钠＋1ul／ml的BD的CD28），按照每孔3x10^5加入圆底96孔板，板是含1ul／mlCD3e的PBS 4度包被24h的。
3d以后能看到细胞是变大变圆的，但是CFSE就是一个大峰，问题究竟出在哪里？