【求助】冰冻切片荧光染色--对BRDU标记的胞核很难染色 WHY？
这个帖子发布于 14 年零 274 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做心肌组织的免疫荧光染色，为三标染色，TRITC标记TNI，FITC标记部分整合了BRDU的胞核，Hoechst标记所有胞核。实验步骤如下：
1.取大鼠心肌组织，生理盐水洗净血液拭干后OCT包埋
2.做4微米冰冻切片
3.电扇下将片子吹干
4.冷丙酮固定10min
5.PBS 5min*3次
6.将片子周围擦干，加山羊血清封闭（中杉公司）室温30min
7.甩干血清，不洗，加一抗 37℃孵育1.5h（一抗为小鼠抗大鼠BRDU，兔抗大鼠TNI，稀释度1：100，实验前一天混匀后待用）抗体来自santa cruz
8.PBS 5min*3次
9.擦干组织周围水分，加二抗 37℃避光孵育 30min（二抗为FITC标记的山羊抗大鼠IgG，TRITC标记的山羊抗兔IgG，稀释度1：100，实验前一天混匀后避光保存待用）抗体来自santa cruz
10.PBS 5min*3次
11.擦干组织周围水分，加Hoechst 33258 浓度 10ug/ml，室温避光孵育5min
12.PBS 5min*3次
13.甘油-PBS封片
想观察心肌损伤后是否有骨髓干细胞动员到心脏并出现分化，故动物模型在处死前一个月腹腔注射BRDU 50mg/kg*2次，间隔2小时。
最近进行了很多次染色实验，TNI和Hoechst都能染上，就是BRDU染不上颜色，几年前有同事做过BRDU单标的实验，能够标记上颜色，他的步骤大致：大鼠注射麻药处死，对心脏进行多聚甲醛灌注固定，脱水，包埋，切片，余下步骤也不是很清楚了。结果BRDU标记的胞核染的很漂亮。我现在比较纳闷，难道是自己模型没造好？还是染色过程存在漏洞？
我也看过不少战友的帖子，他们有进行DNA变性步骤（2N HCL 30min，然后PH8.5的硼酸缓冲液中和10min），但是我们实验室里没有硼酸，病理科只有硼砂也没有硼酸，无法配置硼酸缓冲液，今天的实验中尝试了下DNA变性，2N HCL （1ml 36.5% HCL 与4ml PBS混合 不知道这样配对否）30min，然后就用了0.5M NaOH溶液进行中和，其余步骤同上，PBS洗涤时间改为3min*3次，结果BRDU还是不出来，其他标记颜色都出来了，如下图：（背景有点亮，自己考虑可能是一抗孵育时间过长了）
Hoechst标记的所有心肌胞核 蓝色 2012.2.16实验
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TRITC标记的心肌胞浆 红色 2012.2.16实验
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FITC标记的BRDU心肌胞核 绿色 2012.2.16实验
没有看到明显的细胞核，见到的亮点都是非特异性的着色
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昨天的实验没有进行DNA变性，但在山羊血清封闭前，加了一步0.1% triton x-100 （triton原液与PBS 1：1000混合）打孔 结果如下：
貌似好像染上了，但是用photoshop进行overlap，却发现与HOECHST标记的蓝色核不能很好重叠，故还是考虑非特异性着色
FITC标记的BRDU心肌胞核 绿色 2012.2.15实验
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TRITC标记的心肌胞浆 红色 2012.2.15实验
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Hoechst标记的所有心肌胞核 蓝色 2012.2.15实验
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下面几幅图是一周前染的，步骤就是最上面讲的，既没DNA变性也没TRITON打孔
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希望广大战友帮我想想究竟问题出在哪：是模型没造好，导致干细胞没动员到心脏？还是DNA变性步骤没进行？还是其他问题？
最近还遇到一个问题：上述两种一抗前一天1:1混合，第二天给片子加抗体时发现盛一抗的EP管里有少量絮状无，如果不混合分开装的话则没有，二抗也是，这是为什么？
一抗说明书中写了：Each vial contains 200 μg IgG1 in 1.0 ml of PBS with < 0.1% sodium azide and 0.1% gelatin
二抗说明书中写了：Each vial contains 200 μg rabbit IgG (pre-adsorbed with human IgG) in 0.5 ml of PBS containing 0.02% sodium azide.
1.取大鼠心肌组织，生理盐水洗净血液拭干后OCT包埋
2.做4微米冰冻切片
3.电扇下将片子吹干
4.冷丙酮固定10min
5.PBS 5min*3次
6.将片子周围擦干，加山羊血清封闭（中杉公司）室温30min
7.甩干血清，不洗，加一抗 37℃孵育1.5h（一抗为小鼠抗大鼠BRDU，兔抗大鼠TNI，稀释度1：100，实验前一天混匀后待用）抗体来自santa cruz
8.PBS 5min*3次
9.擦干组织周围水分，加二抗 37℃避光孵育 30min（二抗为FITC标记的山羊抗大鼠IgG，TRITC标记的山羊抗兔IgG，稀释度1：100，实验前一天混匀后避光保存待用）抗体来自santa cruz
10.PBS 5min*3次
11.擦干组织周围水分，加Hoechst 33258 浓度 10ug/ml，室温避光孵育5min
12.PBS 5min*3次
13.甘油-PBS封片
想观察心肌损伤后是否有骨髓干细胞动员到心脏并出现分化，故动物模型在处死前一个月腹腔注射BRDU 50mg/kg*2次，间隔2小时。
最近进行了很多次染色实验，TNI和Hoechst都能染上，就是BRDU染不上颜色，几年前有同事做过BRDU单标的实验，能够标记上颜色，他的步骤大致：大鼠注射麻药处死，对心脏进行多聚甲醛灌注固定，脱水，包埋，切片，余下步骤也不是很清楚了。结果BRDU标记的胞核染的很漂亮。我现在比较纳闷，难道是自己模型没造好？还是染色过程存在漏洞？
我也看过不少战友的帖子，他们有进行DNA变性步骤（2N HCL 30min，然后PH8.5的硼酸缓冲液中和10min），但是我们实验室里没有硼酸，病理科只有硼砂也没有硼酸，无法配置硼酸缓冲液，今天的实验中尝试了下DNA变性，2N HCL （1ml 36.5% HCL 与4ml PBS混合 不知道这样配对否）30min，然后就用了0.5M NaOH溶液进行中和，其余步骤同上，PBS洗涤时间改为3min*3次，结果BRDU还是不出来，其他标记颜色都出来了，如下图：（背景有点亮，自己考虑可能是一抗孵育时间过长了）
Hoechst标记的所有心肌胞核 蓝色 2012.2.16实验
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TRITC标记的心肌胞浆 红色 2012.2.16实验
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FITC标记的BRDU心肌胞核 绿色 2012.2.16实验
没有看到明显的细胞核，见到的亮点都是非特异性的着色
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昨天的实验没有进行DNA变性，但在山羊血清封闭前，加了一步0.1% triton x-100 （triton原液与PBS 1：1000混合）打孔 结果如下：
貌似好像染上了，但是用photoshop进行overlap，却发现与HOECHST标记的蓝色核不能很好重叠，故还是考虑非特异性着色
FITC标记的BRDU心肌胞核 绿色 2012.2.15实验
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TRITC标记的心肌胞浆 红色 2012.2.15实验
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Hoechst标记的所有心肌胞核 蓝色 2012.2.15实验
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下面几幅图是一周前染的，步骤就是最上面讲的，既没DNA变性也没TRITON打孔
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希望广大战友帮我想想究竟问题出在哪：是模型没造好，导致干细胞没动员到心脏？还是DNA变性步骤没进行？还是其他问题？
最近还遇到一个问题：上述两种一抗前一天1:1混合，第二天给片子加抗体时发现盛一抗的EP管里有少量絮状无，如果不混合分开装的话则没有，二抗也是，这是为什么？
一抗说明书中写了：Each vial contains 200 μg IgG1 in 1.0 ml of PBS with < 0.1% sodium azide and 0.1% gelatin
二抗说明书中写了：Each vial contains 200 μg rabbit IgG (pre-adsorbed with human IgG) in 0.5 ml of PBS containing 0.02% sodium azide.
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