【求助】关于细菌接合转移的细节求教，请做过此类实验的大虾不啬赐教

感谢各位大虾的帮忙，说明下情况

小弟最近正在做细菌的结合转移实验，前期做过两轮，但实验结果不甚理想，觉得盲目地做还是不行，所以想针对接合转移的细节向大虾求教一二：

1.供体菌与受体菌不来源于一个菌属，是否影响接合转移实验的成功率：
因为小弟所研究的供体菌为鲍曼不动杆菌，而实验室所有的受体菌均为大肠杆菌（目前大部分文献中也都是使用EC600或者J53的大肠杆菌，有极少数文献使用了沙门氏菌作为受体菌），供体菌属于莫拉菌科的鲍曼不动，而受体菌是属于肠杆菌科的大肠埃希，这两者进行接合转移是否存在影响，还是只要存在F质粒并且菌体具有性菌毛就能相互传播？？？

2.菌体发酵时间问题
这个问题可能不算是接合转移的问题，因为实验和书本基本都是说取对数期的菌体做实验最佳，但对于每种菌甚至每株菌的生长对数期都是不一样的，查过相关文献，大部分都是以OD600 在0.4-0.6时为该菌株的对数期，但问题是培养基的量，接种的原始种子菌的量

都没有一定的规定，因为种子菌的量会直接影响到OD600的数值，原本就很浓的菌液只培养一小段时间自然会很快达到OD600在0.4-0.6

基本上没有类似“0.5个麦氏浊度1ml 加到500ml的LB肉汤培养基中，37℃ 150-180转/分培养16小时”之类的描述......

3.是否需要在培养基中加入一定浓度的抗生素
小弟对于第一步的在供体菌和受体菌培养时加入所对应的抗生素，理解是为了防止接种时带入其他杂菌以致影响培养（不知道是否还有其他的原因，希望大虾指点

），那么对于进行接合转移时，供体菌和受体菌共同培养的培养基中是否应该加入各自对应的抗生素呢？？
如果加入抗生素会不会对接合子带来什么抗生素的压力诱导呢，还是应该在整个接合转移的过程中均不使用抗生素（基本上在超净工作台里工作，带入杂菌的可能性还是很小了）？？？

3.接合子接种抗生素筛选平板时的接种方式：
实验室的师姐说对于接合子接种抗生素平板筛选时，她是直接将静置后的混合菌液摇匀然后用接种环挑去一环划线接种于抗生素平板，也有文献写是去适量菌液然后涂布在抗生素平板上，看起来后者似乎更好些，但问题是这个适量菌液到底是多少呢？从部分战友的问题来看取样量过多或者过浓会导致菌体长得一团糟

4.接合转移有效率的指标
因为很少有文献提到接合转移的有效率问题，基本上都是报道成功或者失败，因此小弟想到底通过什么指标来反映那种温度、PH值、接种量等等条件下最佳的接合转移情况呢？
在国内一篇文献《大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究》（西北农业学报，只帅，席魅力等）探讨了不同受供体比例、不同温度、不同时间等，但对于接合转移有效率的影响，但没有具体列出评价有效率的指标，在网络上看到，使用“接合转移率=（接合子菌数/受体菌菌数）*100%”来计算，但问题是一般的细菌计数（我所知道的就是将菌液比例稀释后与琼脂混匀倒板计数；直接涂布计数；类似细胞计数板计数这三种，也有说采用分光光度计的方式来与麦氏浊度比较

）都很粗糙，这样是否能达到标准呢？？？




以上就是小弟在接合转移实验中遇到的问题，希望各位大虾不啬赐教啊