还在用抗体分选细胞？Cell子刊重磅报道流式分选新技术：让细胞“完好如初”！

APExBIO

如何从复杂的细胞混合物中分离出想要的细胞？有两种常用的流式技术分选方式：荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）。目前这两种方法都是依靠抗体（antibodies）来对目标细胞进行选择性标记和分离的。FACS是利用带荧光基团的抗体去靶向细胞表面或内部的抗原，从而实现靶细胞群或单个细胞的荧光标记。MACS是利用带有抗体的磁性颗粒去靶向细胞表面的抗原，在外加磁场的作用下，将带磁的靶细胞与不带磁的细胞分离开来。 然而这些分离的细胞都带有抗体标记。抗体标记多多少少会影响一些后续实验，即使是工程化改造的抗体，也限制了很多下游应用，比如抗体会阻碍天然信号的传导，有些抗体会引起免疫原性。分离出不带标记的纯净靶细胞似乎是“在做梦”。真的不能实现吗？最近，国际著名期刊《Cell Chemical Biology》发表了一项重磅研究“Aptamers as Reversible Sorting Ligands for Preparation of Cells in Their Native State”，来自美国杜克大学的研究团队开发了一种新的技术可以获取无标记的纯靶细胞，即利用“适体”代替“抗体”来纯化细胞。该团队设计了一种EGFR适体，将该适体带上荧光标记或偶联到磁珠上，通过FACS和MACS分选出纯的EGFR +细胞。重要的是，这种适体标记是可逆的，是可以去除的。该团队利用与适体互补的寡核苷酸将适体从细胞上剥离掉，得到无标记的纯净的细胞，并使细胞恢复天然状态，即EGFR“完好如初”，可以对外界刺激做出响应，启动下游通路信号。这是抗体无法实现的。

Cell Chem Biol.

适体是何方神圣？有人表示第一次听说。适体，英文名字Aptamer，是人工合成的单链的寡核苷酸（可以是RNA或DNA），短（20–80 nt）。适体可以折叠成独特的三维结构，与靶标（蛋白或核酸等分子）特异性结合，这种结合力度很强，甚至强于抗体-抗原相互结合的力度。适体常被用作抗体的替代品。有些人习惯把适体称为“人造抗体”。

▲适体捕获靶标。（图片来源于网络）

该研究团队在体外合成了可以特异性靶向和结合EGFR的RNA适体——“E07”。将E07适体用荧光染料标记或与磁珠结合，分别得到荧光染料-适体结合物和适体-磁珠结合物。可以基于FACS或MACS两种分选技术从EGFR（+）和EGFR（-）细胞混合物中特异性分离和纯化表达EGFR的细胞。如下图所示，首先将荧光染料-适体偶联物（A）或适体-磁珠偶联物（B）与细胞样品混合在一起，让EGFR（+）细胞结合上适体。这种特异性和结合力度不亚于甚至优于抗体。然后利用FACS或MACS将EGFR（+）细胞分离开来。重点来了，这也是该技术的亮点：研究人员合成了与适体序列匹配的寡核苷酸，我们将其称为“解毒剂（Antidote）”。将带有适体标记的EGFR（+）细胞与寡核苷酸解毒剂混和，寡核苷酸解毒剂将适体从EGFR（+）细胞上剥离，最终得到没有任何标记的靶细胞。

▲筛选和分离经适体标记的靶细胞，用解毒剂剥离适体得到不带任何标记的靶细胞，使细胞恢复至原始状态。

 这个解毒剂为什么能剥离适体？与E07适体匹配的解毒剂也是单链的寡核苷酸。该研究团队设计了17种具有不同序列的DNA解毒剂，很短，只有15个核苷酸长，它们与RNA适体的不同区域互补。从中筛选出了一种剥离效果最强的解毒剂（A9）。如下图所示。

▲  被15个碱基DNA解毒剂候选物靶向的E07序列区域（绿色）。

▲  解毒剂A9靶向的目标区域。绿色圆点表示。 上述的荧光染料-适体结合物和适体-磁珠结合物是怎么来的？适体与荧光染料或磁珠的结合都是基于“生物素（biotin）”和“链霉亲和素（streptavidin，以下简写为SA）”之间的高亲和力。上述E07适体是带有biotin标记的，即在适体的5’端连接有biotin分子。将荧光染料连接到链霉亲和素上（例如Streptavidin-Alexa 488，Streptavidin-Cy3，Streptavidin-FITC），链霉亲和素与生物素化的适体结合，从而使适体带上荧光标记。同样，将链霉亲和素连接到磁珠上，生物素化的适体可以与之结合。 利用该技术可以从血液中分离出纯的EGFR（+）细胞群。在人类血液中掺入DiI标记的EGFR（+）A431细胞，浓度相当于白细胞总数的5％。选择这种浓度的A431细胞是为了精确模拟白细胞特定亚群的分离，例如CD4 +或CD8 + T细胞或B细胞。红细胞裂解后，将掺有A431细胞的血液样品与E07适体-磁珠（E07适体带有biotin，磁珠带有SA）一起孵育。利用MACS分离出E07-A431细胞，解毒剂剥离掉适体，得到不带标记的纯EGFR（+）A431细胞群。流式分析显示该细胞群中95%带DiI标记。

▲利用适体从血液中回收了95%的纯EGFR（+）细胞。

 适体分选得到的纯EGFR（+）细胞具有正常的EGFR功能，可对EGF（一种EGFR激动剂）产生反应。将带有荧光染料的链霉亲和素与生物素化的E07适体结合，使E07适体带上荧光标记。当适体与细胞混合物混和后，适体结合到细胞表面的EGFR上，利用FACS筛选出EGFR（+）A431细胞。EGFR由于结合有适体，无法再响应其他配体或激动剂，相当于处于“关闭”状态，无法启动下游信号。当解毒剂从细胞剥离掉适体后，细胞上的EGFR恢复天然功能，该受体恢复EGF诱导的刺激，启动下游信号。需要注意的是，EGFR 抗体的结合在相同条件下是不可逆的，并导致EGFR信号传导和功能永久性丧失。

▲适体分选+解毒剂可恢复天然EGFR状态，恢复EGF刺激。

▲解毒剂剥离掉适体后先前受阻的受体功能完全恢复，EGF结合后可促进受体胞内结构域的磷酸化，从而启动下游信号。

为了提高适体的稳定性和靶向能力，该研究人员对适体进行了修饰。可以用2’-Fluoro-2’-deoxy Cytidine，2’-Fluoro-2’-deoxy Uridine，2'-O-Methyl-NTP等修饰核苷酸对适体进行修饰。适体容易获得，用体外转录试剂盒就可以合成。可以进行大规模生产，成本远远低于抗体，易于纯化并且通常具有低免疫原性。适体比抗体小，能够比抗体更有效地穿透组织到达目标部位。 未来，适体技术将广泛应用于实验室或临床上各种不同细胞类型的分离。例如分离各种免疫细胞群，用于癌症治疗的CD8 + T细胞以及用于造血干细胞移植的CD34 +干细胞等。 原始论文：Gray BP, Requena MD, Nichols MD, SullengerBA. Aptamers as Reversible Sorting Ligands for Preparation of Cells in Their Native State. Cell Chem Biol. 2019 Dec 21.