【原创】大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养及鉴定的经验

做了几个月的大鼠主动脉原代细胞培养，求助了好多站友，得到了很多的帮助，现在基本是做一次成功一次，把经验与大家共享。
1.取200g左右的大鼠，其实大鼠的大小要求不高，大点的操作更方便点，也一样可以出来细胞。
2.麻醉大鼠，直接麻死也没事，消毒，剪开腹部胸部皮肤。

3.剪去大鼠左侧的肋骨可见大鼠的肺，如图所示，把肺翻起，即可见到主动脉，然后把主动脉分离下来，尽量不要有幅度的牵拉。
4.分离下来的血管放入盛有冰的DMEM的培养皿中。
5.培养皿下面一直用冰板垫着，冷的可能保持血管细胞的活性。
6.在体式显微镜下分离血管中膜。

先用一把显微镊子和一把直镊，直镊固定血管，显微镊夹去血管外的血凝块和脂肪组织。然后用显微剪把血管剪开，用两把眼科弯镊，轻轻的刮一下血管内膜，把内皮细胞除去。接下来的是重点，也就是要刮取血管中膜。血管中膜是压，推，把中膜弄下里，千万不要用镊子去撕，撕起来既容易牵拉中膜，又容易破，撕得不完整。如上图，用一个弯镊子压住血管，另一个弯镊子也加压压住血管，然后往下推，这样中膜由于受力就会出现破口，并与外膜分离开来。中膜与外膜的形态区别很容易辨认，中膜刮下来之后还是挺拔的保持着血管的形态，而外膜就是软软的一滩，如下图所示。

7.把中膜移到培养皿的盖子上面，最好沾点DMEM上去，这样更容易剪碎。
8.在培养皿上把中膜剪碎，剪个一百两百下，剪刀要锋利一点，然后用滴管移到培养瓶中。
9.倒置的培养瓶中加入20%胎牛血清的DMEM液，放入培养箱，大概2个小时等组织块黏在培养瓶上之后翻过来。

10. 大概5天左右换液换一次，一般一周左右开始有零星的细胞爬出，两周左右细胞比较多，三周左右可以传代。 这里有一点很重要就是千万不要每天去看，三四天去看一次，每天看长不出来的，我开始也是每天看，一直都长不出来。还有换液也有一点要注意，有一颗一颗的小黑点如图所示的时候，换液要用PBS洗，加入pbs后用力的摇晃培养瓶，把这些小杂物都晃掉，多洗几次，放心，不会把组织块和细胞也晃起来的，组织块细胞贴壁都贴的很牢。

原代细胞由于是从组织块中爬出来的，开始形态各种各样，三角形梭形原型方形的都有，只要是按上面的方法剥离中膜养出来的，鉴定下来基本都是100%纯的平滑肌细胞。以下都是原代细胞的样子，不要怀疑是不是，长到第三代的时候基本就是平滑肌细胞的样子了。

细胞形态学鉴定，就是所谓的hill and velley现象，就是细胞多的地方叠在一起，形成一个hill山峰，细胞少的地方一个都没有，形成一个velley山谷。

下面讲平滑肌细胞的鉴定，我用的是荧光免疫的方法，
1.96孔板中，每孔加入大约3000-5000个细胞，长几天看细胞形态比较好的时候开始做
2pbs洗三遍，每遍5分钟
3 4%甲醛固定，15分钟 pbs洗两遍
4 穿透用0.25% TritonX-100 10分钟pbs洗两遍
5 血清封闭半小时
6加1抗 4度过夜
7 PBST洗两遍 加2抗两小时
8 pbst洗两遍 加DAPI 继续用pbs洗两遍
荧光显微镜拍照 再把DAPI核染的照片与 绿色荧光叠加起来。(图片处理用image pro plus这个软件。)