【求助】核蛋白Rad51 foci 细胞免疫荧光方法检测
我做的是脑胶质瘤细胞 U87,检测X线4Gy照射后核内蛋白RAD51 foci的表达,但做了几次没有结果。
我的步骤是这样的:
1.细胞爬片,片子泡酸后捞出自来水清洗晾干,放于75%酒精中,用时直接捞出,过酒精灯,放于24孔板
2.细胞贴壁后照光,然后放培养箱孵育0.5h后开始做实验
3.固定:碧云天固定液4℃ 20min,之后摇床PBS洗三次,每次5min
4.破膜:150ul无水甲醇(4℃)于-20℃破膜30min,之后摇床PBS洗三次,每次5min
5.封闭:150ul碧云天封闭液封闭1h,室温,之后摇床PBS洗三次,每次5min
6.一抗:150ulabcam (ab213),1:200,4℃过夜,之后摇床PBS洗三次,每次5min
7.二抗,150ul invitrigon 488 goat anti-mouse,室温1.5h避光,之后摇床PBS洗三次,每次5min
8.染核:150ul 碧云天DAPI,15min,之后摇床PBS洗三次,每次5min
9.封片:碧云天抗淬灭封片剂,封片,未用指甲油周围封片,然后于孔板上放于避光湿盒中,第二天激光共聚焦观察。
但扫出来的图片是这样的:





我一直担心我一抗坏掉了,后来我请教了一个老师,她说是我破膜没破好,建议我用0.5%Triton X-100,4℃ 15min,一个师姐说她破膜后细胞都变圆了。昨天我又做了一遍,我各用两种方法重复破膜两次(两张片子,每张一种方法),做出来的结果类似于最后一张图,核只占一部分,有点也是在胞浆里(我的图好多那种强亮绿点,都不确定是不是表达的),就感觉这种蛋白在胞浆里表达一样。
我要毕不了业了,想撞豆腐的心都有了,希望大家给点建议和意见,非常感激!