紧急！关于realtimePCR条件如何摸索的问题？？

各位大虾！
最近一直在做realtime PCR, 由于是叫公司做，先期摸条件都是他们在弄，自己很少能参与进去，但等到分析结果时发现了很多问题，却又不知道该如何解决xx(xx(
问题一：
我需要跑好几个基因，但公司跑的时候都用一个条件，说是增加基因之间的可比性，而且都用两步法，即94℃2分钟预变性，然后93℃10秒, 60℃40秒共40个循环，，但这样跑出来的结果是有几个基因如GAPDH是好的，但有几个就不行，出峰都很迟，且阳性对照都做不出来，明显是不对的。和公司的技术人员联系，他们说这样做是有道理的，因为两步法可以保证TAQ酶的活性，使结果更灵敏，且他们认为只要标准品跑得好就说明条件是好的。
但我也问过其他人，有说是标本应该另行摸条件的，而且应该跟普通PCR一样用跑胶的方法摸好了再去跑。
现在我的问题是到底应该怎样来摸索realtime PCR的条件？:?)

问题二：
除了PCR程序外，还有PCR体系问题，现在我的体系是40ul，其中dNTP 200pmol/ul，引物各0.600 pmol/ul，荧光探针0.25pmol/ul, Taq酶2 u, cDNA 模板4 ul，也就是探针每个反应用10pmol，引物用24pmol.其实这样做是很浪费引物和探针的，不知能否再优化一些？

问题三：
还有，我发现做realtimePCR反应不同锅之间的差距很大，是否应该让所有的TEST都在一个锅里做才行，在做目的基因的同时是否每锅都得同时跑GAPDH？？

难过ing!!
:-S:-S
各位高手千万给个解答啊